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申请/专利权人：南京市食品药品监督检验院

摘要：本发明公开了一种快速测定低致敏婴幼儿配方乳粉中牛乳过敏原的方法，属于检测技术领域。本发明将低致敏婴幼儿配方乳粉样品经过特定条件的碳酸氢铵溶液蛋白提取、蛋白含量测定、蛋白还原和烷基化后进行特定条件酶解，制备待测液，直接采用串联液相色谱质谱法进行检测，可快速获得低致敏婴幼儿配方乳粉中牛乳过敏原含量。本发明方法具有如下优势：高灵敏度、低检出限、高准确度、成本低廉、操作简便、易于推广，且检测时间小于14小时。

主权项：1.一种快速定量乳粉中牛乳过敏原的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）蛋白提取：将乳粉和400~600mM碳酸氢铵溶液按照1g:50mL的用量比混匀，超声提取8~12min，离心，去除上层油脂，得到乳粉蛋白提取液；（2）可溶性蛋白含量测定：测定所述乳粉蛋白提取液中可溶性蛋白含量；（3）蛋白还原和烷基化：取所述乳粉蛋白提取液与碳酸氢铵溶液混匀，再加入二硫苏糖醇溶液混匀，水浴加热，冷却至室温；再加入碘乙酰胺溶液，混匀，避光放置，得到烷基化的蛋白提取液；（4）蛋白酶解：根据步骤（2）得到的可溶性蛋白含量，按照胰蛋白酶和可溶性蛋白的质量比为1:10将所述烷基化的蛋白提取液和胰蛋白酶溶液混匀，在37℃下酶解10~14小时，酶解后的样品中加入甲酸终止酶解反应，将所得溶液用超纯水定容，离心、取上清液过膜，得到待测溶液，将其注入进样瓶中避光保存；（5）检测：采用液相色谱-串联质谱联用仪对所述待测溶液进行检测，得到质谱响应值；其中：液相色谱的条件为：流动相A：体积浓度为0.1%甲酸-水溶液；流动相B：体积浓度为0.1%甲酸-乙腈溶液；仪器：ABSCIEXTripleQUAD6500；色谱柱：WatersACQUITYUPLCPeptideCSHC18，150mm×2.1mm，粒径1.7μm；柱温：35℃；进样量：5μL；流动相洗脱梯度如下：时间0.00min，流速0.3mLmin，90%流动相A，10%流动相B；时间15.00min，流速0.3mLmin，60%流动相A，40%流动相B；时间15.10min，流速0.3mLmin，0%流动相A，100%流动相B；时间18.00min，流速0.3mLmin，0%流动相A，100%流动相B；时间18.10min，流速0.3mLmin，90%流动相A，10%流动相B；时间24.00min，流速0.3mLmin，90%流动相A，10%流动相B；不同牛乳过敏蛋白的定量多肽如下：α-乳白蛋白：VGINYWLAHK；β-乳球蛋白：VLVLDTDYK；αS1-酪蛋白：FFVAPFPEVFGK；αS2-酪蛋白：FALPQYLK；β-酪蛋白：VLPVPQK；κ-酪蛋白：SPAQILQWQVLSNTVPAK；不同牛乳过敏蛋白的质谱分析条件如下：α-乳白蛋白：母离子，600.83mz；子离子817.44,654.37,931.48*，mz；DP60V，CE28.4eV；β-乳球蛋白：母离子，533.30mz；子离子641.28,754.36,853.43*，mz；DP60V，CE25.1eV；αS1-酪蛋白：母离子，692.87mz；子离子823.44,991.53,920.49*，mz；DP60V，CE33.0eV；αS2-酪蛋白：母离子，490.28mz；子离子551.32,761.46,648.37*，mz；DP60V，CE23.0eV；β-酪蛋白：母离子，390.75mz；子离子471.29,681.43,568.35*，mz；DP60V，CE18.1eV；κ-酪蛋白：母离子，990.54mz；子离子1056.61,1242.68,1370.74*，mz；DP40V，CE47.5eV；其中*表示定量离子；将所述待测溶液的质谱响应值代入牛乳过敏蛋白标准曲线，并计算得到乳粉中牛乳过敏原含量，采用外标法定量；不同牛乳过敏蛋白标准曲线如下：α-乳白蛋白：y=4.5181e4x+1.9274e5,r2=0.9989；线性范围：10~1000μgg；β-乳球蛋白：y=2.3897e5x+2.7569e5,r2=0.9996；线性范围：1~100μgg；αS1-酪蛋白：y=9.5596e5x+1.2214e4,r2=0.9989；线性范围：0.2~20μgg；αS2-酪蛋白：y=5.4349e4x-6.7579e2,r2=0.9995；线性范围：0.05~5μgg；β-酪蛋白：y=3.8697e4x-1.603e3,r2=0.9994；线性范围：0.1~10μgg；κ-酪蛋白：y=9.244e3x+5.6286e4,r2=0.9995；线性范围：10~1000μgg；标准曲线中y为质谱响应值；x为所述待测溶液中牛乳过敏蛋白浓度，μgg；r2为相关系数的平方；牛乳过敏蛋白标准曲线的检出限为：α-乳白蛋白10.0μgg、β-乳球蛋白1.0μgg、αS1-酪蛋白0.2μgg、αS2-酪蛋白0.05μgg；β-酪蛋白0.1μgg、κ-酪蛋白10.0μgg；定量限为α-乳白蛋白20.0μgg、β-乳球蛋白2.0μgg、αS1-酪蛋白0.4μgg、αS2-酪蛋白0.1μgg；β-酪蛋白0.2μgg、κ-酪蛋白20.0μgg；乳粉中牛乳过敏原的含量的计算公式为：X=C×Vm×1000式中：X—乳粉中过敏原蛋白的含量，μgg；C—通过代入牛乳过敏蛋白标准曲线计算得到的所述待测溶液中牛乳过敏蛋白浓度，ngmL；V—步骤（4）定容的体积，mL；m—乳粉质量，g。

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