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申请/专利权人：青海大学

摘要：本发明公开了一种康定鼠尾草根中天然自由基清除剂Salvinolone的精准分离方法和应用。具体方法：提取、在线自由基清除剂活性色谱峰识别、硅胶柱富集及反相制备液相色谱柱纯化四个步骤。制备方法中的提取溶剂，硅胶柱富集、反相制备液相色谱柱纯化所使用的溶剂均可以回收利用，色谱分离材料可重复利用，保证了分离过程中平均成本比较低廉，高压色谱分离可以保证产品的纯度大于95％；原料要求不高、成本低廉，一般野生的或市售的康定鼠尾草根即可，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作，同时对环境友好；分离采用硅胶柱富集材料可以装于中压柱层析系统中，易于规模化；分离纯化中使用的反相制备液相色谱，为快速的等度方法，非常适宜大规模生产。

主权项：1.一种康定鼠尾草根中天然自由基清除剂Salvinolone的精准分离方法，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤1，提取：将康定鼠尾草根阴干，粗碎后按料液比1g：3～20mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次5～12h，过滤、合并滤液，即得滤液A，该滤液A减压浓缩后，按硅胶的量：康定鼠尾草根的量＝1:1～5拌样并干燥，即得康定鼠尾草提取物拌样样品；步骤2，在线自由基清除剂活性色谱峰识别：在所述康定鼠尾草提取物拌样样品中加入其质量0.1～2倍，体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mgmL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到康定鼠尾草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统识别康定鼠尾草中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-PurC18AQ250×4.6mm，5μm色谱柱，检测波长为260nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；步骤3，硅胶柱富集：康定鼠尾草提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为260nm的紫外检测器检测，依次收集制备色谱图中色谱峰馏分Fr1～Fr4，经色谱分析比对，锁定馏分Fr3中含有活性色谱峰，该馏分Fr3经减压浓缩，并按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得康定鼠尾草目标组分Fr3；步骤4，反相制备液相色谱柱纯化：所述康定鼠尾草目标组分Fr3进一步通过反相制备液相色谱柱纯化，经检测波长为260nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr31，经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂Salvinolone，在分离得到的康定鼠尾草天然自由基清除剂Fr31中加入适量色谱甲醇进行溶解，配制样品浓度为0.2mgmL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到康定鼠尾草天然自由基清除剂Fr31样品溶液，取1mL样品，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统验证康定鼠尾草Fr31的活性；经质谱、氢谱和碳谱表征及结构解析，确定Fr31为化合物Salvinolone，Salvinolone化学结构式为：

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