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申请/专利权人：中国科学院西北高原生物研究所

摘要：本发明涉及一种康定鼠尾草中Salvinolone化学对照品的制备方法，包括硅胶柱富集、固相萃取除杂和反相液相制备色谱精制三个步骤。第一步采用硅胶柱富集，可将样品中Salvinolone得到高效富集；第二步采用固相萃取除杂，可获取纯度约70％的Salvinolone的精细组分；第三步采用反相液相制备色谱制备。本发明可获取高纯度Salvinolone对照品，收率较高80％，而且非常适宜规模生产，对原料要求不高，一般野生或种植的康定鼠尾草醇提物即可，易于批量备料；填料便宜易得；固相萃取柱除杂，该固相萃取柱可以再生循环使用，平均价格低廉，易于规模化；精制中采用反相液相制备色谱制备，为快速的等度方法。

主权项：一种康定鼠尾草中Salvinolone化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴硅胶柱富集：将按常规方法制得的棕红色浸膏状的康定鼠尾草中的醇提物经硅胶柱色谱分离：用氯仿‑甲醇‑水的混合溶剂按5～10倍的柱体积进行洗脱，并按每份500mL收集馏分，采用薄层色谱检测收集Rf值为0.7～0.9的馏分，该馏分经减压干燥后即得红色粉末状的富含Salvinolone的组分粗样。⑵固相萃取除杂：将富含Salvinolone的组分粗样用50％～60％甲醇溶解，过滤得到滤液A，该滤液A上固相萃取柱分离，以3～5倍柱体积的体积分数为50％～60％的甲醇溶液进行洗脱，收集该洗脱物并经减压干燥得Salvinolone的精细组分；富含Salvinolone的组分粗样与所述固相萃取材料比例为1g：20mL。⑶反相液相制备色谱精制：所述Salvinolone的精细组分用其质量5～10倍的体积分数为70％～80％的甲醇溶液溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98％的红色粉末状的Salvinolone对照品。

全文数据：一种康定鼠尾草中SaIvinoIone化学对照品的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种Salvinolone化学对照品的制备方法，尤其涉及一种康定鼠尾草中Sa1vino1one化学对照品的制备方法。背景技术[0002]康定鼠尾草Salviaprattii系属鼠尾草属（SalviaL.、唇形科Labiatae植物。现代研宄表明鼠尾草植物中的化学成分主要包括酚酸类及萜类。1989年Long-ZeLin等从鼠尾草中分离出SalvinolonePhytochemistry,1989,281:177-181oSalvinolone是康定鼠尾草中含量比较高的丹参酮类化合物，现代药理学研究表明化合物Salvin〇l〇ne具有抗菌、抗癌、降低血液中胆固醇含量和抑制HIV蛋白酶等多种药理活性。为了加快康定鼠尾草的生产销售和相关新药的研发步伐，发展高纯度Salvinolone的高效制备方法，尤其规模化制备技术显得尤为重要。[0003]岳会兰和赵晓辉分析试验室，20〇8,SI;416-418建立一种RP-HPLC方法，用于测定康定鼠尾草根中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮nA的含量，为康定鼠尾草开发利用提供依据。目前，从康定鼠尾草植物中规模化快速制备化合物Salvinolone的文献未见报道。发明内容[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一种工艺简单、易规模化的一种康定鼠尾草中[0005]Sa1vino1one化学对照品的制备方法。[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：[0007]—种康定鼠尾草中Sa1vino1one化学对照品的制备方法，包括以下步骤：[0008]⑴硅胶柱富集：[0009]将按常规方法制得的棕红色浸膏状的康定鼠尾草中的醇提物经硅胶柱色谱分离：用氯仿-甲醇-水的混合溶剂按5〜10倍的柱体积进行洗脱，并按每份500mL收集馈分，采用薄层色谱检测收集Rf值为〇•7〜0•9的馏分，该馏分经减压干燥后即得红色粉末状的富含Salvinolone的组分粗样。[0010]⑵固相萃取除杂：[0011]将富含Salvinolone的组分粗样用5〇%〜60%甲醇溶解，过滤得到滤液A，该滤液A上固相萃取柱分离，以3〜5倍柱体积的体积分数为50%〜60%的甲醇溶液进行洗脱，收集该洗脱物并经减压干燥得Salvinolone的精细组分;富含Salvinolone的组分粗样与所述固相萃取材料比例为lg:20mL。[0012]⑶反相液相制备色谱精制：[0013]所述Salvinolone的精细组分用其质量5〜1〇倍的体积分数为70%〜80%的甲醇溶液溶解，经〇.45wn微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的红色粉末状的Salvinolone对照品。[00M]进一步，所述步骤⑴和所述步骤⑵及所述步骤⑶中的减压干燥的条件均是指真空度为0•06〜0•〇9MPa，温度为50〜70°C。[0015]进一步，所述步骤⑴中的氯仿-甲醇-水的混合溶剂是指氯仿、甲醇及水按9:丨:〇.1的体积比混合而成。[0016]进一步，所述步骤⑴中的薄层色谱检测的条件是指展开剂为氯仿、甲醇及水按9:1:0.1的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液。[0017]进一步，所述步骤⑵中固相萃取柱是指装有反向XAquaC1840〜6〇Wn填料的固相萃取柱。[0018]进一步，所述步骤⑶中反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径5〇mm，反相液相制备柱固定相为10umMegressC18，流动相为体积分数7〇%〜8〇%的甲醇-水溶液，进样体积为10〜15mL，流速为60mLmin。[0019]本发明与现有技术相比具有以下优点：[0020]1、本发明工艺简单、回收率高。[0021]第一步采用硅胶柱富集，可将样品中Salvinolone得到高效富集;第二步采用固相萃取除杂，可获取纯度约70%的Salvinolone的精细组分;第三步采用反相液相制备色谱制备，可获取高纯度对照品，且收率较高80%。[0022]2、本发明采用的技术手段非常适宜规模化生产。[0023]原料要求不高，一般野生或种植的康定鼠尾草醇提物即可，易于批量备料;第一步采用硅胶柱富集，填料便宜易得;第二步固相萃取柱除杂，该固相萃取柱可以再生循环使用，平均价格低廉，易于规模化;第二步精制中米用反相液相制备色谱制备，为快速的等度方法，也非常适宜规模生产。附图说明[0024]下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。[0025]图1为本发明实施例1Salvinolone精细组分的HPLC分析图谱254nm。[0026]图2为本发明实施例1Salvinolone精细组分的液相制备图谱254nm。[0027]图3为本发明实施例1Salvinolone的反相液相色谱纯度分析254nm。具体实施方式[0028]实施例1一种康定鼠尾草中Salvinolone化学对照品的制备方法，包括以下步骤：[0029]⑴硅胶柱富集：[00^0]将按常规方法制得的棕红色浸膏状的康定鼠尾草中的醇提物2.0Kg经硅胶柱色谱分离：用氯仿-甲醇-水的混合溶剂按5倍的柱体积进行洗脱，并按每份50〇1111收集馈分，采用薄层色谱检测收集Rf值为0•7〜0•9的馈分，该馏分经减压干燥后即得红色粉末状的富含Salvinolone的组分粗样19.6g。[0031]其中：[0032]减压干燥的条件是指真空度为〇.〇9MPa，温度为5TC;[OO33]氯仿-甲醇-水的混合溶剂是指氯仿、甲醇及水按9:1:〇.1的体积比混合而成。[0034]薄层色谱检测的条件是指展开剂为氯仿、甲醇及水按9:1:0.1的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液。[0035]⑵固相萃取除杂：[0036]将富含Sa1vino1one的组分粗样用50%甲醇溶解，过滤得到滤液a，该滤液A上固相萃取柱分离，以5倍柱体积的体积分数为50的甲醇溶液进行洗脱，收集该洗脱物并经减压干燥得Sa1vino1one的精细组分15.4g。[0037]其中：[0038]减压干燥的条件是指真空度为〇.〇9MPa，温度为50°C;[0039]固相萃取柱是指装有反向XAquaC1840〜60W1填料的固相萃取柱；[0040]富含Salvinolone的组分粗样与所述固相萃取材料比例为1g:2〇mL。[0041]3反相液相制备色谱精制：[0042]所述Salvinolone的精细组分用其质量5倍的体积分数为8〇%的甲醇溶液溶解，经0•45wb微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的红色粉末状的Salvinolone对照品13.0g。[0043]其中：[0044]减压干燥的条件是指真空度为〇.〇9MPa，温度为50°C;[0045]反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径50mm，反相液相制备柱固定相为lOwnMegressC18,流动相为体积分数80%的甲醇-水溶液，进样体积为10〜15mL，流速为60mLmin。[0046]实施例2[0047]—种康定鼠尾草中Salvinolone化学对照品的制备方法，包括以下步骤：[0048]⑴硅胶柱富集：[0049]将按常规方法制得的棕红色浸膏状的康定鼠尾草中的醇提物1•〇Kg经硅胶柱色谱分离：用氯仿-甲醇-水的混合溶剂按10倍的柱体积进行洗脱，并按每份5〇〇mL收集镏分，采用薄层色谱检测收集Rf•值为0•7〜0•9的馈分，该馏分经减压干燥后即得红色粉末状的富含Salvinolone的组分粗样10.2g。[0050]其中：[0051]减压干燥的条件是指真空度为0.06MPa，温度为70°C;[OO52]氯仿-甲醇-水的混合溶剂是指氯仿、甲醇及水按9:1:0•1的体积比混合而成。[0053]薄层色谱检测的条件是指展开剂为氯仿、甲醇及水按9:1:0.丨的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液。[0054]⑵固相萃取除杂：[0055]将富含Salvino1one的组分粗样用60%甲醇溶解，过滤得到滤液A，该滤液A上固相萃取柱分离，以3倍柱体积的体积分数为60%的甲醇溶液进行洗脱，收集该洗脱物并经减压干燥得Salvinolone的精细组分7.4g。[0056]其中：[0057]减压干燥的条件是指真空度为〇.〇6MPa，温度为70°C;[OO58]固相萃取柱是指装有反向XAquaCl840〜6〇Mi填料的固相萃取柱；[0059]富含Sa1vino1one的组分粗样与所述固相萃取材料比例为1g:2OmL。[0060]⑶反相液相制备色谱精制：[0061]所述Salvinolone的精细组分用其质量10倍的体积分数为70%的甲醇溶液溶解，经0.45M1微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压千燥即得纯度大于98%的红色粉末状的Salvinolone对照品6.6g。[0062]其中：[0063]减压干燥的条件是指真空度为0.06MPa，温度为70°C;[0064]反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径50mm，反相液相制备柱固定相为10M1MegressCIS，流动相为体积分数70%的甲醇_水溶液，进样体积为10〜15mL，流速为60mLmin。[0065]实施例3[0066]—种康定鼠尾草中Salvinolone化学对照品的制备方法，包括以下步骤：[0067]⑴硅胶柱富集：[0068]将按常规方法制得的棕红色浸膏状的康定鼠尾草中的醇提物0.5Kg经硅胶柱色谱分离:用氯仿-甲醇-水的混合溶剂按8倍的柱体积进行洗脱，并按每份500mL收集馏分，采用薄层色谱检测收集Rf值为0•7〜0•9的馈分，该馏分经减压干燥后即得红色粉末状的富含Salvinolone的组分粗样4.9g。[0069]其中：[0070]减压干燥的条件是指真空度为0.08MPa，温度为60°C;[0071]氯仿-甲醇-水的混合溶剂是指氯仿、甲醇及水按9:1:0.1的体积比混合而成。[0072]薄层色谱检测的条件是指展开剂为氯仿、甲醇及水按9:1:0.1的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液。[0073]⑵固相萃取除杂：[0074]将富含Salvino1one的组分粗样用55%甲醇溶解，过滤得到滤液A，该滤液A上固相萃取柱分离，以4倍柱体积的体积分数为55%的甲醇溶液进行洗脱，收集该洗脱物并经减压干燥得Salvinolone的精细组分3.4g。[0075]其中：[0076]减压干燥的条件是指真空度为O.OSMPa，温度为60°C;[0077]固相萃取柱是指装有反向XAquaC1840〜60mi填料的固相萃取柱；[0078]富含Salvinolone的组分粗样与所述固相萃取材料比例为lg:20mL。[0079]⑶反相液相制备色谱精制：[00S0]所述Salvinolone的精细组分用其质量8倍的体积分数为75%的甲醇溶液溶解，经0.45um微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经反相液相制备色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于98%的红色粉末状的Salvinolone对照品3.0g。[0081]其中：[0082]减压干燥的条件是指真空度为0.08MPa，温度为60°C;[0083]反相液相制备色谱分离的工作参数是指色谱柱柱长25〇mm、直径50mm，反相液相制备柱固定相为lOwnMegressC18,流动相为体积分数75%的甲醇-水溶液，进样体积为10〜15mL，流速为60mLmin〇

权利要求：1.一种康定鼠尾草中Salvinolone化学对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴硅胶柱富集：将按常规方法制得的棕红色浸膏状的康定鼠尾草的醇提物经硅胶柱色谱分离：用氯仿、甲醇及水按9:1:0•1的体积比混合而成的氯仿-甲醇-水混合溶剂按5〜10倍的柱体积进行洗脱，并按每份500mL收集馏分，采用展开剂为氯仿、甲醇及水按9:1:0•1的体积比混合而成的混合溶剂，显色剂为体积浓度10%的浓硫酸乙醇溶液为检测条件的薄层色谱检测收集Rf值为0•7〜0•9的馏分，该馏分经真空度为0•〇6〜0•〇9MPa，温度为50〜70°C条件下减压干燥后即得红色粉末状的富含Salvinolone的组分粗样；⑵固相萃取除杂：将富含Salvinolone的组分粗样用50%〜60%甲醇溶解，过滤得到滤液A，该滤液A上装有反向XAquaC1840〜60um填料的固相萃取柱分离，以3〜5倍柱体积的体积分数为50%〜60%的甲醇溶液进行洗脱，收集该洗脱物并经真空度为0•06〜0•09MPa，温度为50〜70°C条件下减压干燥得Salvinolone的精细组分;富含Salvinolone的组分粗样与所述固相萃取材料比例为lg:20mL;3反相液相制备色谱精制：所述Salvinolone的精细组分用其质量5〜10倍的体积分数为70%〜80%的甲醇溶液溶解，经0•45mi微孔滤膜过滤，得到滤液B，该滤液B经工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径50mm，反相液相制备柱的固定相为lOwnMegreSsC18，流动相为体积分数70%〜80%的甲醇-水溶液，进样体积为10〜15mL，流速为60mLmin的反相液相制备色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馈分经真空度为0•06〜0•09MPa，温度为50〜70°C条件下减压干燥即得纯度大于98%的红色粉末状的Salvinolone对照品。

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