买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：瓦斯特根公司

摘要：公开了构建连续连接的核酸分子拷贝的方法。连续连接的核酸分子拷贝可用于对相同核酸分子进行数次测序，从而提高测序的总体准确性。连接的核酸分子拷贝可以通过环化5个核酸分子、进行滚环扩增和用包含5‑3外切核酸酶和或活瓣内切核酸酶活性的切口和聚合酶脱支来构建。

主权项：1.一种构建包含核酸分子拷贝的脱支双链构建体的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i通过将核酸分子连接至至少一个衔接子来使其环化，所述衔接子包含至少一个切口内切核酸酶识别位点；ii通过将所述核酸分子暴露于核苷酸、链置换聚合酶和至少一种引物以产生一个或多个分支核酸构建体来进行滚环扩增；iii暴露于识别所述识别位点的切口内切核酸酶，使得仅在ii中产生的构建体的双链区的一侧产生切口；和iv暴露于包含5'-3'外切核酸酶和或活瓣内切核酸酶活性的聚合酶。

全文数据：构建核酸分子拷贝的方法较早申请的优先权要求US62450,070申请日：2017年1月24日US62451,734申请日：2017年1月29日US62473,700申请日：2017年3月20日US62506,706申请日：2017年5月16日US62516,263申请日：2017年6月7日US62576,974申请日：2017年10月25日US62576,992申请日：2017年10月25日序列表包含本文所述DNA序列的命名为SequenceListing_2018TSAV0121_ST25.txt的文件的序列表是4KB大小，于2018年1月创建，并且其全部内容通过引用并入本文。技术领域本文提供的方法涉及核酸测序领域。背景技术核酸序列信息对于科学研究和医学目的是重要的。序列信息使得能够对疾病进行遗传易感性的医学研究，侧重于改变基因组的研究，例如癌组织的基因组，以及针对疾病的药物的合理设计。序列信息对于基因组学、进化和群体研究，基因工程应用和流行病学重要性的微生物研究也很重要。可靠的序列信息对于亲子鉴定和取证也很重要。一直需要新技术来降低成本，提高测序输出的质量和数量。有可能通过简化流程和降低成本来彻底改变测序的有前途的技术基于纳米孔的检测。纳米孔是很小的孔，可以通过它们进行DNA转运，从而根据穿越DNA的序列导致离子电流的可检测中断。在使用纳米孔装置的单核苷酸分辨率下的测序以高报告错误率进行Goodwin等，2015。由于这些错误在测序期间随机发生，因此重复相同DNA链的测序程序若干次将基于来自重复读数的共有序列产生测序结果，从而提高总体准确度并降低总体错误率。发明内容本文公开的方法涉及核酸测序。公开了构建连续连接的核酸分子拷贝的方法。本文公开的某些实施方案涉及构建包含核酸分子拷贝的脱支构建体的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i通过附着核酸分子到至少一个衔接子来环化核酸分子，所述衔接子包含至少一个切口核酸内切酶识别位点的至少一部分；ii进行滚环扩增；iii暴露于识别所述识别位点的切口内切核酸酶，使得仅在ii中产生的构建体的双链区的一侧产生切口；和iv暴露于包含5'-3'外切核酸酶和或活瓣flap内切核酸酶活性的聚合酶。在相关的实施方案中，可以对适于测序的衔接子进行步骤iv中产生的构建体的连接。本文公开的其他实施方案涉及构建核酸分子拷贝的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i进行滚环扩增；ii用溶解酶脱支，从而解离三元连结体和其他分支产物；和iii用包含5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶和或连接酶处理，从而使带切口、有缺口或含有活瓣的产物免于进一步降解。本文公开的其他实施方案涉及产生包含环状核酸分子拷贝的脱支构建体的方法，所述环状核酸分子包含含有至少一个片段的链，所述片段具有在所述链的所述区段与具有与所述区段的所述序列互补的序列的另一区段退火的情况下可被序列特异性切口核酸内切酶识别的序列，所述序列不具有存在于所述链中的其互补序列，所述方法应用于一个或多个环状核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i将所述环状核酸分子暴露于包含核苷酸和链置换聚合酶的反应溶液，以产生包含所述环状核酸分子的多个拷贝的分支构建体；和ii通过包括以下步骤脱支所述分支构建体：a暴露于识别所述序列的切口核酸内切酶，从而在所述分支构建体上产生切口；b暴露于包含5'-3'核酸外切酶和或活瓣核酸酶活性的聚合酶，以在a中产生的切口延伸3'末端，从而产生脱支的双链构建体。附图说明在下面给出的在本公开的范围内可使用的各种实施方案的详细描述中，参考附图，其中：图1A是环状核酸分子的示意图；图1B是构建环化分子的方法的示意图；图1C是构建环化分子的方法的示意图；图1D是构建环化分子的方法的示意图；图1E是产生分支构建体的方法的示意图；图2A是脱支方法的示意图；图2B是支化和脱支产物的示意图；图3是RCA反应产物的琼脂糖凝胶电泳可视化；图4是具有对核酸酶介导的降解敏感的位点的分支构建体的示意图；图5A是RCA反应产物和对照的琼脂糖凝胶电泳可视化；图5B是RCA反应产物的琼脂糖凝胶电泳可视化；图6A是支化产物的示意图；图6B是支化产物的示意图；图7是发夹衔接子的示意图；图8A至8C是制备核酸分子的双链拷贝的方法的示意图；图8D至8E是具有对溶解酶敏感的位点的支化产物的示意图；图9是RCA反应产物的脱支方法和琼脂糖凝胶电泳可视化的示意图；图10是脱支方法的示意图；图11是脱支方法的示意图；图12是使核酸分子环化的方法的示意图；图13是使核酸分子环化的方法的示意图；图14是分支和脱支RCA反应产物的琼脂糖凝胶电泳可视化；图15是分支和脱支RCA反应产物的琼脂糖凝胶电泳可视化；和图16是本文所述实验中使用的DNA梯的图像。具体实施方式本文描述的方法构建与核酸分子连续连接的核酸分子的拷贝。这样的拷贝是有用的，因为它们可以通过诸如纳米孔装置的测序仪连续测序，从而实现重复读数，从而提高整体测序准确度。我们通过示例的方式并且出于对实施方案的说明性讨论的目的示出了这些细节。我们呈现这些细节以提供我们认为对本公开的各种实施方案的原理和概念方面的最有用且易于理解的描述。在这方面，我们没有试图比对所公开方法的基本理解所必需的更详细地显示结构细节。我们旨在该描述应该与附图一起进行。这应该使得本领域技术人员明白所公开方法的几种形式如何在实践中体现。术语和定义我们意欲并且旨在在任何未来的解释中以以下定义和解释为准，除非在以下实施例中明确且毫无疑义地修改或当该含义的应用使得任何解释无意义或基本上无意义。如果术语的解释使其无意义或基本无意义，我们旨在将该定义从Webster词典第3版中获取。如本文所用的“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如单或三磷酸酯。核苷是由嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核苷碱组成的化合物，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、7-脱氮腺嘌呤，其可以与戊糖例如核糖、2'-脱氧核糖或2',3'-二脱氧核糖的异头碳连接。最常见的酯化位点是与戊糖的C-5位置连接的羟基在本文中也称为5'位或5'末端。戊糖的C-3位置在本文中也称为3'位或3'末端。术语“脱氧核糖核苷酸”是指具有戊糖2'-脱氧核糖的核苷酸。术语“核糖核苷酸”是指具有戊糖核糖的核苷酸。术语“双脱氧核糖核苷酸”是指具有戊糖2',3'-二脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以在如此陈述或上下文暗示或允许的情况下掺入和或修饰。如本领域技术人员所理解的，“互补的”通常是指形成经典Watson-Crick碱基对的特定核苷酸双链体。例如，两条核酸链或两条核酸链的一部分被称为互补或具有互补序列，只要它们能够彼此形成完美的碱基配对双螺旋。“核酸分子”是由共价连接在一起的至少两个核苷酸组成的核苷酸的聚合物。核酸分子可以是多核苷酸或寡核苷酸。核酸分子可以是脱氧核糖核酸DNA、核糖核酸RNA或两者的组合。核酸分子可包含体内产生的或通过用甲基转移酶例如，dam甲基转移酶处理产生的甲基化核苷酸。如所指出的，核酸分子可以是单链或双链的。双链核酸分子可包含非互补区段。核酸分子通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下，它们可以具有替代主链，包括例如磷酰胺Beaucage和Iyer,1993和其中的参考文献；Letsinger和Mungall,1970；Sprinzl等人,1977；Letsinger等人,1986；Sawai,1984；以及Letsinger等人,1988，硫代磷酸酯Mag等人,1991；和美国专利5,644,048Yau,1997，二硫代磷酸酯Brill等人,1989，邻-甲基亚磷酰胺键Eckstein,1992，和肽核酸主链和键Egholm等人,1992；Meier和Engels,1992；Egholm等人,1993；和Carlsson等人,1996。其他核酸类似物包括具有双环结构的那些，其包括锁定的核酸Koshkin等人,1998；正主链Dempcy等人,1995；非离子型主链美国专利号5,386,023Cook和Sanghvi,1992、5,637,684Cook等人,1997、5,602,240Mesmaeker等人,1997、5,216,141Benner,1993和4,469,863Ts’o和Miller,1984；vonKiedrowski等人,1991；Letsinger等人,1988；Jung等人,1994；Sanghvi和Cook,1994；DeMesmaeker等人,1994；Gao和Jeffs,1994；Horn等人,1996和非核糖主链，包括描述于美国专利号5,235,033Summerton等人,1993和5,034,506Summerton和Weller,1991和Sanghvi和Cook,1994中的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内Jenkins和Turner,1995。几种核酸类似物描述于1997年6月2日Rawls，C&ENews第35页RAWLS,1997。本文描述的对“核酸分子”进行的所有方法可以应用于单个核酸分子或多于一个核酸分子。例如，所述方法可以应用于许多相同的核酸分子，例如衍生自单个核酸分子的PCR拷贝。在另一个实例中，所述方法还可以应用于许多不同序列的核酸分子，例如基因组DNA分子的提取和剪切片段。在另一个实例中，所述方法还可以应用于多组核酸分子，每组包括特定核酸分子的拷贝，例如衍生自多重PCR测定的产物的组合。上述实例是非限制性的。核酸分子可以连接到表面例如，官能化的固体支持物、涂覆衔接子的珠子、涂有引物的表面等。除非另有说明，否则参与反应或认为暴露于条件或经历过程以引起反应或事件发生的“核酸分子”或其他等同短语包括核酸分子和与其相关的每件事物有时称为“部分”或“环境”。在本文所述的方法之前或期间与核酸分子结合例如，结合、杂交、连接、掺入、连接等的掺入的核苷酸、连接的衔接子、杂交的引物或链等是或变为核酸分子的一部分，并且包含在术语“核酸分子”中。例如，在步骤中掺入核酸分子中的核苷酸在随后的步骤中成为核酸分子的一部分。例如，在进行本文所述方法之前已经附着于核酸分子的衔接子是核酸分子的一部分。术语“衔接子”是指包含至少一部分已知序列的单链例如，发夹衔接子或双链寡核苷酸或多核苷酸。衔接子可以不包括位点，或一个或多个用于限制性内切核酸酶识别或识别且切割的位点。衔接子可包含甲基转移酶识别位点。衔接子可包括一个或多个可切割特征或其他修饰。衔接子可以或可以不锚定到表面，并且可以包括一种或多种修饰例如，以允许锚定到脂质膜或其他表面和或与一种或多种酶例如解旋酶或其他分子连接。“发夹衔接子”是包含单链的衔接子，其中至少一部分表现出自身互补性。这种自身互补性形成双链结构。发夹衔接子可包含修饰的核苷酸或其他修饰，例如，其能够附着于表面、切口、限制酶识别等。术语“聚合”是指共价连接核苷酸以形成核酸分子或核酸构建体或通过骨架键一次一个核苷酸将核苷酸共价连接至现有核酸分子或核酸构建体的过程。后一种情况也称为“通过聚合延伸”。聚合通过聚合延伸可以是模板依赖性的或模板非依赖性的。在模板依赖性聚合中，产生的链与在聚合反应期间用作模板的另一条链互补，而在模板非依赖性聚合中，向链中添加核苷酸不依赖于互补性。“模板链”：如本领域技术人员已知的，术语“模板链”是指核酸分子的链，其用作核苷酸掺入核酸分子的引导物，所述核酸分子包含可延伸的3'末端，只要核酸分子经历模板依赖性聚合反应。模板链通过碱基对互补性引导核苷酸掺入，使得新形成的链与模板链互补。“可延伸的3'末端”是指核酸分子或核酸构建体的游离3'末端，所述3'末端能够在模板依赖性聚合过程中与核苷酸形成骨架键。“可延伸链”是核酸分子的链，其包含可延伸的3'末端。“构建体”可以指衔接子发夹或其他或其他方法制造的实体，例如锚定的寡核苷酸或多核苷酸。“区段”：当提及核酸分子或核酸构建体时，“区段”是包含至少一个核苷酸的核酸分子例如，模板链或核酸构建体例如，衔接子的一部分。除非另有说明或上下文暗示，否则术语“附着”和“连接”可互换使用。当提及限制性酶，包括切口核酸内切酶时，术语“识别位点”和“限制性位点”可互换使用，除非上下文另有说明或暗示，并且指可被在这些位点的内部或外部切割的酶识别的位点。核酸分子可以使用本领域已知的提取方法从几种来源获得核酸分子。来源的实例包括但不限于任何生物的体液例如血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液和精液和组织正常或病理性的，例如肿瘤，包括人样本；环境样本包括但不限于空气、农业、水和土壤样本；研究样本如PCR产品；纯化的样品，例如纯化的基因组DNA、RNA等。在某些实施方案中，基因组DNA获自全血或来自血液或细胞培养物的细胞制备物。在进一步的实施方案中，核酸分子包含富集转录序列的完整基因组DNA的子集。在进一步的实施方案中，核酸分子包含转录组即，在细胞或细胞群中产生的一组mRNA或“转录物”或甲基化组即，甲基化位点的群体和基因组中的甲基化模式。在一些实施方案中，感兴趣的核酸分子是基因组DNA分子。核酸分子可以是天然存在的或遗传改变的或合成制备的。核酸分子可以直接分离而无需扩增，或使用本领域已知的方法通过扩增分离，所述方法包括但不限于聚合酶链反应PCR、链置换扩增SDA、多重置换扩增MDA、滚环扩增RCA、滚环扩增RCR和其他扩增方法。核酸分子也可以通过克隆获得，包括但不限于克隆到载体如质粒、酵母和细菌人工染色体中。在一些实施方案中，核酸分子是mRNA或cDNA。使用常规技术，分离的mRNA可以被反转录成cDNA，如在GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeriesVols.I-IVGreen,1997或MolecularCloning:ALaboratoryManualGreen和Sambrook,2012中描述的。使用常规技术分离基因组DNA，如在MolecularCloning:ALaboratoryManualGreen和Sambrook,2012中公开的。然后通过常规技术将基因组DNA分级或片段化至所需大小，包括使用限制性内切核酸酶的酶消化、随机酶消化或其他方法，例如剪切或超声处理。核酸分子的片段大小可以根据使用的来源和文库构建方法而变化。在一些实施方案中，片段长度为300至600或200至2000个核苷酸或碱基对。在其他实施方案中，片段长度小于200个核苷酸或碱基对。在其他实施方案中，片段长度超过2000个核苷酸或碱基对。在另一个实施方案中，分离特定大小或特定大小范围的片段。这些方法在本领域中是公知的。例如，凝胶分级分离可用于产生碱基对范围内的特定大小的片段群，例如500个碱基对±50个碱基对。在一个实施方案中，DNA在片段化后变性以产生单链片段。在一个实施方案中，扩增步骤可以应用于片段化核酸分子群。这种扩增方法是本领域公知的，并且包括但不限于：聚合酶链反应PCR，连接链反应有时称为寡核苷酸连接酶扩增OLA，循环探针技术CPT，链置换测定SDA，转录介导扩增TMA，基于核酸序列的扩增NASBA，滚环扩增RCA用于环化片段和侵入性切割技术。在一些实施方案中，受控的随机酶“CoRE”片段化方法被用来制备片段Peters等人,2012。可用于切割核酸分子的其他合适的酶促、化学或光化学切割反应包括但不限于WO07010251Barnes等人,2007和US7,754,429Rigatti和Ost,2010中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，特别是当期望分离长的片段诸如片段长度为约150至约750千碱基时，可以应用美国专利8,518,640Drmanac和Callow,2013的DNA分离方法。限制酶在许多实施方案中，切口核酸内切酶用于在核酸分子或衔接子等内产生可延伸的3'末端。切口核酸内切酶可仅水解双链体的一条链以产生被“切口”而非被切割的DNA分子。切口可以产生3'-羟基和5'-磷酸。切口酶的实例包括但不限于Nt.CviPII、Nb.BsmI、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI或Nt.BstNBI。切口核酸内切酶可具有非回文识别位点。切口核酸内切酶可从例如NewEnglandBioLabs获得。一些切口内切核酸酶可以是切口归巢内切核酸酶诸如I-BasI和I-HmuILandthaler等人,2006Landthaler等人,2006。合适的切口核酸内切酶也描述于Walker等人,1992；Wang和Hays,2000；Higgins等人,2001；Morgan等人,2000；Xu等人,2001；Heiter等人,2005；Samuelson等人,2004；和Zhu等人,2004，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。聚合酶几种聚合剂可用于本文所述的聚合反应中。例如，取决于核酸分子，DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶可用于模板依赖性聚合反应。DNA聚合酶和它们的性质详细描述于Kornberg和Baker,2005中。对于DNA模板，可用许多DNA聚合酶。在若干实施方案中使用具有链置换能力的DNA聚合酶。在一些实施方案中，使用热稳定聚合酶，例如NewEnglandBiolabs、ThermoSequenaseTMAmersham或TaquenaseTMScienTech,StLouis,Mo.。有用的聚合酶可以是进行性的或非进行性的。进行性是指DNA聚合酶能够使用相同的引物连续进行核苷酸的掺入，持续相当长的长度而不与延伸的引物或模板链或延伸的引物和模板链两者解离。在一些实施方案中，在聚合反应过程中，本文使用的进行性聚合酶在延伸多至至少50个核苷酸至约1.5千碱基、多至至少约1至约2千碱基，并且在一些实施方案中至少5kb-10kb期间保持与模板结合。这对于某些实施方案是合乎需要的，例如，其中进行与核酸分子连接的多个连续拷贝的有效构建。聚合酶的详细描述可发现于US20070048748Williams等人,2007、美国专利6,329,178Patel和Loeb,2001、6,602,695Patel和Loeb,2003、6,395,524Loeb等人,2002、7,981,604Quake,2011、7,767,400Harris,2010、7,037,687Williams等人,2006和8,486,627Ma,2013，其通过引用并入本文。连接酶可以通过使用连接将衔接子和其他核酸构建体连接到核酸分子上。几种类型的连接酶适合并用于实施方案中。连接酶包括但不限于NAD+-依赖性连接酶，包括tRNA连接酶、TaqDNA连接酶、ThermusfiliformisDNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、TthDNA连接酶、ThermusscotoductusDNA连接酶、热稳定连接酶、Ampligase热稳定DNA连接酶、VanC-类型连接酶、9°NDNA连接酶、TspDNA连接酶和通过生物勘探发现的新型连接酶。连接酶还包括但不限于ATP依赖性连接酶，包括T4RNA连接酶、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、PfuDNA连接酶、DNA连接酶1、DNA连接酶III、DNA连接酶IV和新型连接酶，包括野生型、突变体同种型和基因工程变体。存在具有连接酶活性的酶，例如拓扑异构酶Schmidt等人,1994。实施例本文描述的方法可以采用常规技术和诸如有机化学、聚合物技术、分子生物学、细胞生物学和生物化学的领域的描述，这些都在本领域的技术范围内。这些常规技术包括但不限于聚合、杂交和连接。这样的常规技术和描述可以在标准实验室手册中发现，例如“GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeriesVols.I-IV”Green,1997、“PCRPrimer:ALaboratoryManual”Dieffenbach和Dveksler,2003、“MolecularCloning:ALaboratoryManual”Green和Sambrook,2012和其他Berg,2006；Gait,1984；NelsonandCox,2012，所有这些都为了所有目的通过引用以它们的整体并入本文。所有引用的出版物例如，专利、专利申请、期刊文章、书籍均以其整体包括在本文中。使用易错测序平台的高度精确测序可以通过测序DNA构建体来实现，每个DNA构建体包含单个原始DNA分子的多个拷贝。例如，可以使用纳米孔将这种DNA构建体连接到适于测序的衔接子上。滚环扩增RCA可以产生环状核酸分子的拷贝。环状核酸分子可以是例如与单链衔接子连接或与其自身连接的单链核酸分子，或与双链衔接子连接或与其自身连接的双链核酸分子，或者包含链101和102并连接到衔接子103和104的双链DNA分子，如图1A所示。衔接子103和104是发夹衔接子，并且可以是钝端的或包括突出端。103和104可以相同或不同。这种构建体是本领域技术人员熟知的哑铃形环状分子，并且可以进行滚环扩增，以产生原始DNA分子的多个拷贝。环状核酸分子的其他实例包括插入环状分子的基因组DNA片段、或PCR产物、或其他DNA分子或构建体例如，质粒、载体、合成的环状DNA；http:www.biosyn.comcircular-oligonucleotide.aspx。插入可以例如通过使用连接酶将插入物连接到环状分子上，或通过使用转座酶来完成。在插入之前，可以将DNA片段连接到包含转座酶识别位点的衔接子上，或者可以使用包含转座酶识别位点的引物进行PCR。转座酶的使用是本领域技术人员公知的示例方案描述于http:www.lucigen.comdocsmanualsMA126E-EZ-Tn5-Transposase.pdf。此外，环状核酸分子可以是基因组选择性环化的产物，根据类似于在Natsoulis等人,2011；Myllykangas等人,2011中描述的程序。夹板连接也可以被用于产生环状核酸分子Drmanac等人,2016。在图1B所示的另一个实施方案中，通过首先除去双链核酸分子的两条链中的一条来构建环状分子。特别地，显示了双链核酸分子，其在其5'末端包含区段107和108。107和108可以是衔接子的部分或PCR引物的部分。107和108是相似的，因此109108的补体至少部分地与107互补。在一些实施方案中，107的5'末端未被磷酸化，而108的5'末端被磷酸化。在步骤a期间，通过例如酶消化除去包含108的链，留下包含107和109的链完整无缺。例如，步骤a可以包括与λ核酸外切酶一起温育，所述核酸外切核酸酶可以消化具有磷酸化的5'末端的链，但不消化具有非磷酸化的5'末端的链。在步骤b，剩余的链被允许自退火，通过例如将温度升高至95℃，并然后冷却。或者，剩余的股线彼此退火。随后可将步骤b中的退火产物连接到发夹衔接子上，从而产生环化分子。在其他实施方案中，107和108不相似，107在其5'末端未被磷酸化，而108在其5'末端被磷酸化，并且步骤a中的剩余链使用ssDNA特异性连接酶如CircLigaseI或II自身连接以形成环状分子。在其他实施方案中，如图1C和1D中所示，可以通过夹板连接构建环状分子，其中单链核酸分子可以在另一个称为“夹板”的另一个单链核酸分子的帮助下自我连接。夹板与待自身连接的核酸分子的区域至少部分互补，使得夹板与核酸分子的退火使其末端足够接近以通过合适的连接酶连接。例如，如果夹板和核酸分子都是ssDNA，可以使用T4DNA连接酶。在另一个实例中，夹板是ssRNA，核酸分子是ssDNA，合适的连接酶是SplintR连接酶NewEnglandBioLabs。在图1C所示的实施方案中，通过首先除去双链核酸分子的两条链中的一条来构建环状分子。特别地，显示了双链核酸分子，其在其5'末端包含区段110和111。110和111可以是衔接子的部分或PCR引物的部分。在一些实施方案中，110的5'末端未被磷酸化，而111的5'末端被磷酸化。在步骤a期间，通过例如酶消化除去包含111的链，留下包含110的链完整无缺。例如，步骤a可以包括与λ核酸外切酶一起温育，所述核酸外切核酸酶可以消化具有磷酸化的5'末端的链，但不消化具有非磷酸化的5'末端的链。在步骤b期间，允许剩余的链退火至夹板112例如，ssDNA，夹板112至少部分地与110以及来自步骤a的剩余链的3'端的区域互补。退火至夹板使剩余链的两端闭合，以便它们可以通过合适的连接酶连接。步骤b中的退火产物可以参与连接反应，从而产生环化分子。在图1D中的另一个实施方案中，显示了双链核酸分子120例如，基因组DNA片段、PCR产物；例如，平末端、dA尾，其与衔接子连接。在一些相关实施方案中，衔接子包括彼此互补的两个区段121和122，以及两个非互补区段123和124。在步骤a期间，通过例如向变性120及其连接的衔接子施加热量来产生单链。在步骤b期间，允许步骤a中产生的单链与夹板125例如，ssDNA退火，夹板125至少部分地与衔接子序列例如，至少部分的123和在至少部分的124互补。退火至夹板使单链的两端闭合，以便它们可以通过合适的连接酶连接。步骤b中的退火产物可以参与连接反应，从而产生环化分子。哑铃形或圆形ssDNA分子的滚环扩增可以通过在这些分子的单链区上产生引发位点来引发。引发位点可以通过退火的引物，或使用引发酶或引发酶-聚合酶PrimPols产生PICHER和Blanco,2014。环状dsDNA分子的滚环扩增可以通过引入例如切口或间隙以产生可延伸的3'末端，或通过变性，然后在所得变性分子的单链区域上产生引发位点来引发。在图1E所示的实例中，对环状核酸分子进行滚环扩增。通过链置换聚合酶的延伸置换链105，其成为引物例如106的模板以退火并提供额外的聚合酶延伸位点，从而产生支化产物。箭头显示聚合酶的延伸方向。支化产物例如图1E所示的产物需要转化为双链核酸分子以适合测序。执行这种转化的方法在图2A和2B中示出。在一些实施方案中，环状ssDNA分子201，例如图2A中所示的，包括切口位点202，如果切口位点变为双链，则切口位点202可被序列特异性切口核酸内切酶特异性切口例如，如果链被退火至201的至少一部分，则所述部分包括202。切口位点可以在这种序列特异性内切核酸酶的切口核酸内切酶识别位点的内部或外部或开始或结束处。201可以进行RCA[步骤a到c]。例如，201可以暴露于引物和链置换聚合酶，例如phi29DNA聚合酶。在步骤a期间，通过产生包含多个201拷贝的生长链203，可以延长退火至201的引物。在步骤b期间，另外的引物例如204与203退火。它们的延伸[步骤c]产生支化产物，其中在包含与202相同的序列的链段中产生多个切口位点。在步骤d期间，在步骤a至c期间产生的RCA构建体暴露于切口核酸内切酶，其可以切口与202相同的位点，产生切口例如205。切口优先在RCA产生的链段中产生，所述链段包含具有与201的相同序列的201的拷贝，但不是包含具有与序列201互补的序列的201的拷贝的链段。在步骤e中，通过使用包含5'-3'外切核酸酶活性和或活瓣核酸酶活性的聚合酶，例如DNA聚合酶I或Taq聚合酶，可以延长在切口处暴露的3'末端。延长使结构脱支，产生单独的双链核酸分子。任何剩余的切口都可以用连接酶密封。箭头显示聚合酶的延伸方向。步骤e中产生的双链分子可任选地在衔接子连接之前或在衔接子连接之后进一步经受大小选择方法例如，AMPureXP选择，作为例如清除方案的一部分以去除未连接的衔接子，以优先检索包含原始分子201的期望拷贝数的长构建体，如图2B步骤f所示。使这些材料经受测序例如，衔接子连接和纳米孔测序或聚合酶依赖性测序[例如，PacificBiosciences测序仪]可以优先产生长读数，这通过共有测序支持期望的准确度水平。例如，可以使用本文所述的方法将携带可附着于表面的锚定部分的衔接子和用于将DNA穿过纳米孔的解旋酶或其他运动蛋白连接至由RCA产生的双链DNA。这种衔接子和转座体方法描述于https:nanoporetech.comrapidsequencingandCaruccio,2011中。纳米孔测序可以产生长读数，每个长读数包含原始DNA分子的多个拷贝。例如，可以对这些读数进行Blastn分析，以识别每次读数内的拷贝。然后，可以对每个读数内的拷贝进行多重比对分析例如，使用ClustalOmega和共有序列构建例如，mEMBOSS的cons函数。图2B中所示的分支结构S1，其不如图2A所示进行脱支，对于测序是有问题的，因为即使它们仍然可以与具有其末端207、208和209的衔接子连接，但是，例如，预期测序会产生许多不期望的短读段，因为在这种情况下短的分支不能优先与较长的链例如203分开。在过去已经提出了脱支的方法，涉及剪切和或冗长的需要酶温育之间的纯化步骤的方案Zhang等人,2006；Li等人,2016a,p.-；Li等人,2016b。剪切作为脱支方法可能是不利的，因为它通常需要增加样品体积，因此样品需要稀释和再浓缩，因此增加了整个过程的成本。剪切也可能是一种低效的脱支方法，如图3所示。第二道表示RCA样品的一部分，其中支化材料粘附在凝胶孔中。第三道是使用Covarisg-TUBE柱进行剪切的同一样品的一部分。尽管样品按照制造商的方案进行了5轮g-TUBE处理，但没有观察到碎片材料的可检测的增加。使用可以在分支点不加选择地裂解的酶或其他试剂的脱支方法可以产生大多数不期望的短产物，例如图2BS2中所示的那些。图4显示了对核酸酶如S1和MBNase敏感的分支DNA构建体中的位置。S1核酸酶可以切割图4中黑色和白色箭头指向的位置，其表示ssDNA区域白色箭头和与双链中的切口或间隙相对的位置黑色箭头。绿豆核酸酶可以主要切割ssDNA区域。这些核酸酶可能难以优化，因为它们可以在DNA呼吸期间切割双链区域。S1核酸酶可以导致短片段，因为它可以在每个分支点切割。它与phi29聚合酶脱支步骤的组合被提出，但是这些方案是费力的并且其他人报告不得改善片段大小并且仅产生适度的脱支。已知MBNase比S1核酸酶更有选择性地切割，并且与缺口相对的备用位置可能导致更长的ssDNA片段。图5A显示了通过使用MBNase进行试图脱支的实验。第一图第2和3道示出了分别用每μl反应0.5和0.25单位MBNase处理37℃，30分钟的类似RCA样品。第4道显示了未经处理的类似RCA反应。尽管在相同条件下用MBNase处理的λ噬菌体基因组DNA样品显示出指示MBNase依赖性非特异性降解的涂片，但没有明显的脱支发生。具体地，第二图第1和2道显示分别用每μl反应0.5和0.25单位的MBNase处理的λ噬菌体DNA。两条泳道都含有相同DNA量的样品。泳道1中的涂片比泳道2中的涂片更明显，这与更多MBNase应引起更多降解的观点一致。这是一个意想不到的结果，因为MBNase应该有一些切割，至少在ssDNA片段。在图5B所示的另一个实验中，外切核酸酶III与MBNase组合使用，以测试在切口位点处产生间隙是否会通过产生更大面积的ssDNA来促进MBNase消化。泳道2显示未处理的RCA样品，泳道3显示用外切核酸酶III和MBNase处理的RCA样品。令人惊讶的是，没有出现较小尺寸的涂片，这表明MBNase介导的降解。由于MBNaseI特异性地切割单链区域，实验结果表明没有显著存在单链区域。这可以通过分支迁移的机制来解释，如图6A所示，在此期间，包括链611及其互补链612的一部分的分支逆着延伸链610的延伸方向即朝向大白箭头的方向移动。这种分支迁移可以取代链610的3'末端并导致611至613的单链部分的再退火，如图6Ab和b2所示[b2是b的替代表示]。易受ssDNA核酸酶影响的区域由小的白色和黑色箭头指向；小白色箭头指向的区域可以被MBNaseI或S1核酸酶切割，而黑色箭头指向的区域可以被S1核酸酶切割。分支迁移可导致单链区域例如小白箭头指向的区域再退火，从而阻止获取核酸酶，如MBNaseI。由分支迁移引起的结构如图6B所示。结构c是复制叉结构，其可以在RCA中发生或由结构b产生，例如在被置换的3'末端被用于RCA的链置换聚合酶如phi29DNA聚合酶的3'-5'外切核酸酶活性消化的情况下。结构d类似于霍利迪Holliday结，并且之前已经描述为复制叉回归的结果。在该结构中，610的3'端侧的一部分与612的5'端侧的一部分退火。结构e是三元连结体，其可以在610的3'端可以退火到611并且通过移位612延伸的情况下形成。分支迁移是DNA链交换的能量上有利的模式Lee等人,1970。移位的3'末端，例如图6Ab中的，以及导致图6Be的错误引发事件已经在链置换扩增反应的别处描述Lasken和Stockwell,2007。复制叉前面的正扭转应力可导致叉回归，导致图6B结构dPostow等人,2001a；Postow等人,2001b。叉回归可能频繁[30％的复制叉；Subramanian和Griffith,2005]在其中DNA末端自由移动有困难的复杂DNA结构中，或在存在多个竞争的复制叉延长的位置中Bermejo等人,2012，如在RCA中。通过复制叉回归产生的四元连结体可以通过切割在两个相对的链中在连接点通过溶解酶处理Ishino等人,2006；Rass,2013，如T7核酸内切酶I，GEN1等，使链如613可以被裂解，从而导致短的产物，如图2BS2所述。诸如d和e的结构不提供MBNase可接近的ssDNA区域，并且可以解释MBNase消化RCA样品的难度。这种结构可以被靠近分支点的溶解酶切割Dickie等人,1987。复制叉例如图6B中的c可以通过靠近白色和黑色箭头指向的位置的溶解酶裂解。GEN1核酸内切酶Rass等人,2010；Chan和West,2015可切割接近由白色箭头指示的位置，而T7核酸内切酶I和Mus81-Eme1核酸内切酶Ciccia等人,2003可以切割接近黑色箭头指向的位置。用这些内切核酸酶消化可以产生包含切口和或间隙和或活瓣结构的脱支产品，其可以通过使用具有活瓣核酸酶和或5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶进一步修复解析。任何切口都可以用连接酶密封。使用溶解酶内切核酸酶的一个挑战是它们的特异性和切割效率根据DNA结构而变化Chan和West，2015。GEN1切割5'-活瓣比切割Holliday连接更显著有效。此外，它不能切割3'-活瓣。此外，它可以显示出序列特异性偏好Bellendir等人,2017。使用溶解酶的另一个缺点是在衔接子连接用于测序之前需要除去溶解酶通过例如蛋白酶处理和或纯化。另一个缺点是溶解酶可能需要仔细滴定。正如NewEnglandBioLabs所指出的，控制酶例如，T7核酸内切酶I的量和用于切割特定底物的反应时间是重要的。本文公开的方法包括以优先方式在由RCA产生的分支结构内的链段中引入切口，而不切口与切口的链段互补的区段。在与图2A中的实施方案有关的一些实施方案中，202是归巢切口核酸内切酶的切口位点。在许多实施方案中，201包含至少一个202位点，并且不包含与202完全互补的任何区段。在许多实施方案中，在步骤d之前使链置换聚合酶失活例如，热灭活，并且在步骤e之前使切口酶失活例如，热灭活。在许多其他实施方案中，哑铃形构造例如图1A中所示的构造用作RCA的模板[步骤a到c；2A]。在这样的实施方案中，使用发夹衔接子，例如图7中所示的那些。在一些实施方案中，发夹衔接子701用于形成哑铃形构造，例如图1A中所示的构造。701包含至少部分位于其环中的位点702，其可以在构建与所述环互补的链的情况下例如在RCA期间通过切口核酸内切酶识别，使环呈双链。在其他实施方案中，使用发夹衔接子703，其在其茎中包含切口核酸内切酶识别位点和在所述识别位点内的错配区域704，其包含至少一个错配碱基。当在RCA期间构建与发夹互补的链时，错配使得发夹茎的仅一侧通过切口核酸内切酶可识别。在其他相关的实施方案中，703包含其茎中的切口核酸内切酶识别位点的一部分，优选具有错配区域，并且在连接至也包含相同识别位点的一部分的核酸分子时，所述识别位点变得完整。在一些实施方案中，切口核酸内切酶在RCA产生的链段中产生切口，所述链段包含具有与包含切口位点的发夹衔接子的环的序列相同的序列的拷贝，但不是包含具有与所述发夹衔接子的环的序列互补的序列的拷贝的链段。如图8A所示，在步骤a期间，分支结构暴露于切口核酸内切酶，其切口链801和802，但不是它们的互补链803和804。在步骤b期间，通过使用包含5'-3'核酸外切酶活性和或活瓣内切核酸酶活性的聚合酶，例如DNA聚合酶I或Taq聚合酶，可以延长在切口处暴露的3'末端。延长使得结构脱支，产生两个独立的双链核酸分子。任何剩余的切口都可以用连接酶密封。类似地，在图8B中，所示的分支结构可以暴露于切口内切核酸酶切口806和与807互补的805的部分。807和与806互补的805的部分没有被切口。在其他实施方案中，使用切口核酸内切酶，其识别待通过RCA或全基因组扩增扩增的核酸分子内的位点。重要的是要注意，切口可能发生在图8A和B中所示的相反链上，与图8C中所示的一致。在这种情况下，结构b2可以是脱支的，而结构e则不能。在一些实施方案中，用另一种限制性内切核酸酶切口可以遵循图8A和B中的延伸步骤b。这种限制性内切核酸酶可以在图8A和B步骤a中用内切核酸酶识别相同的位点，但是在相对侧切口。例如，在第一切口内切核酸酶是Nt.BbvCI的情况下，另一个是Nb.BbvCI。切口步骤之后可以是延伸和或连接酶步骤，如图8A和B中所述。或者，在一些实施方案中，溶解酶如T4内切核酸酶VII和T7内切核酸酶I可以用于解离支链结构Rice和Correll,2008；Wyatt和West,2014。内切酶已在全基因组扩增WGA但不是RCA反应之前使用，用于脱支的目的，并且没有认识到可能在链置换过程中出现结构的复杂性Zhang等人,2006。实际上，这些出版物仅考虑图6A中的结构a，而没有考虑分支迁移效应。此外，在那些应用中，在纯化WGA材料后使用溶解酶，不是通过在相同缓冲液中添加溶解酶来至少部分与WGA同时使用或在WGA之后使用。另外，在Zhang等人,2006中DNA聚合酶I温育后是溶解酶反应，但不同时进行。图8D显示了结构b2和c。诸如T4核酸内切酶VII和T7核酸内切酶I的溶解酶在由黑色箭头指示的点周围的区域处切割。例如，T7核酸内切酶I倾向于朝向分支点或错配区域的5'侧切割。在每个底物结合事件中，由于这些酶的二聚体性质，溶解酶通常在两条链上切割。如果它们被设计为以具有一个活性亚基和一个非活性亚基的异二聚体存在，溶解酶只能一次切口一次Rice和Correll,2008。通过溶解酶裂解结构b2和c产生比图2A、2B和8A中描述的切口和延伸方法更短的产物。图8E显示三元连结体结构e，其中三个箭头黑色、白色和灰色指向潜在的溶解酶切割区域实际切割位点位于由所述箭头指示的点附近。在单个底物结合事件中，这种结构通常在箭头指示的任何两个区域处被切割。例如，在由黑色和白色箭头指示的区域处的切割产生两种产物，一种包含805的一部分和807的互补部分未示出，以及产物f，其包括806、807a807的一部分和805a805的一部分。取决于切割的位置，产品f可包括切口、间隙或活瓣，如图8E所示。这种不连续或错配的区域可以被识别并在例如箭头所示区域通过溶解酶进一步裂解，产生更短的产物。通过用聚合酶和或连接酶处理，可以使产物f免于进一步裂解。关于产物f的另一个重要问题是它可以是嵌合产物，因为在RCA或WGA期间，链806可以是源自另一个RCA模板的置换链，其3'端侧退火至807并开始延伸。相反，图8A和B中的切口和延伸方法包括脱支而不保留这种嵌合构建体。在其他实施方案中，如图9和10所示，适合于测序的双链构建体可以通过在环状分子上切割和延伸至少一个位点而由滚环扩增产物构建，所述环状分子用作滚环扩增反应的模板。环化的核酸分子可以是例如与衔接子902连接的单链核酸分子901，或包含链903和904的双链DNA分子，并连接到衔接子905和906，如图9所示。衔接子905和906是发夹衔接子，并且可以是钝端的或包括突出端。905和906可以相同或不同。可以使用的环状分子及其构建方法也在图1A至1D中描述。所有这些类型的环状构建体都是本领域技术人员公知的，并且可以进行滚环扩增，以产生原始DNA分子的多个拷贝。滚环扩增的产物是单链分子，其需要转化为双链结构以适合某些测序方案，包括纳米孔测序。在图9中所示的一个实施方案中，包括衔接子905的环状分子经受滚环扩增，其中延伸链910沿箭头方向延伸。在该实施方案中，衔接子905包含可导致环状分子裂解的特征。例如，该特征可以是一个或多个可切割的核苷酸，或一个或多个切口核酸内切酶识别位点切口限制性位点，或其组合。在一个实施方案中，905包含核糖核苷酸，其在5'末端被RNaseH2切割以产生切口。具有逆转录酶和链置换活性的聚合酶，例如BstDNA聚合酶，可用于包含核糖核苷酸的模板的滚环扩增。在另一个实施方案中，905包含切口限制性位点，其被切口核酸内切酶识别，该切口内切核酸酶在衔接子905内或外部在环状分子中产生切口。例如，在步骤a中，将试剂加入到滚环扩增反应溶液中以识别905中的特征并切割环状分子。910的延伸在切割位点处停止，而在切割的环状分子中新产生的3'末端通过随后添加或已经存在于反应溶液中的聚合酶延伸，以将910转化为双链结构。在另一个实施方案中，905包含尿嘧啶dU，其可以通过UDG切除。得到的无碱基位点可以通过例如用内切核酸酶VIII处理来切割。通过留下磷酸-3'-末端切割核酸内切酶VIII，其可以用磷酸酶如rSAP进一步处理以除去磷酸盐并使3'末端可延伸。磷酸化的3'-末端也可以通过外切核酸酶或具有固有3'-5'核酸外切酶活性的聚合酶除去，例如phi29聚合酶。用USER酶NewEnglandBioLabs可方便地完成dU的切除和切割。在一些实施方案中，待复制的核酸分子包含可切割的特征。例如，待复制的核酸分子可以是扩增子，其是包含可切割核苷酸如核糖核苷酸或dUTP的PCR反应的产物。聚合酶如Therminator可用于进行这种扩增反应。例如，当PCR反应包含dUTP和或包含尿嘧啶dU的引物时，可以使用Taq聚合酶。可以使用包含核糖核苷酸或dU的模板的聚合酶可用于进行滚环扩增。例如，Bst聚合酶具有逆转录酶活性。而且，可以使用包含至少一种具有逆转录酶活性的聚合酶的聚合酶混合物。例如，phi29聚合酶可与具有逆转录酶活性的Klenowexo-一起使用，或与逆转录酶一起使用。在一个实例中，对λ噬菌体基因组DNA进行PCR，所述PCR包含Taq聚合酶、正向引物和包含单个dU位点的反向引物。将PCR产物连接到包含dT突出端的发夹衔接子上，从而产生环状分子。用phi29聚合酶对环状分子进行滚环扩增，如图9的琼脂糖凝胶电泳图像所示。高分子量产物的强力生产表明，当phi29聚合酶在模板链上遇到dU时，它可以容易地延伸。图9所示的方法可以容易地概括为包括其中至少一个衔接子或待复制的核酸或两者都包含至少一个可切割特征的实施方案。例如，图10显示了包含两个衔接子1002的环状分子1001的情况，其用作用于滚环扩增的模板。1003是在箭头方向上延伸同时移动其部分1004的生长链。在步骤a期间，1001及其周围环境暴露于切口内切核酸酶，其识别衔接子1002内的限制性位点并产生切口1005，从而产生1006和1007，它们是1001的一部分。在步骤b期间，链置换聚合酶可以在1006的3'末端开始延伸，从而置换1007。在步骤c期间，完成1003和1006二者的延伸，产生包含1006的双链构建体1008，如图所示。可切割核苷酸和合适的酶和其他用于切割的试剂在PCTUS2015027686Tsavachidou,2015中描述。如图1E中和本文其他地方所描述的，滚环扩增通常产生支化产物。图11显示了类似于图9和10中的构造，其已经经过步骤a和b。如图所示，在滚环扩增期间移位的链具有与其退火的其他链，例如1101、1102和1103，形成分支结构。在步骤c期间，朝向箭头方向的完全延伸移位1101、1102和1103。为了选择性地获得期望的双链产物而不是移位的1101、1102和1103链，一个或多个捕获特征1104可以包含在用作滚环扩增反应的模板的环状分子中。捕获特征可以是例如可以促进选择性纯化的部分。在一个实例中，捕获特征可以是环状分子内任何地方的生物素化核苷酸例如，在衔接子内，或在非衔接子部分内，例如，在环状分子包括包含生物素化核苷酸的PCR的产物的链的情况下。这种生物素化的核苷酸可以容易地被捕获，例如，通过链霉抗生物素蛋白包被的珠，从而选择性地将期望的双链构建体与其他链分开。1104可包含例如是可光切割的PC-生物素，以促进从链霉抗生物素蛋白包被的底物中容易地释放捕获的双链构建体，而不干扰变性双链构建体。也可以使用其他可切割的捕获特征。聚合酶如phi29可以通过在模板中的生物素化的核苷酸容易阅读，例如以下事实所证明：phi29聚合酶可以参与包括生物素-dUTP的滚环扩增反应Mullenix等人,2002。实施例1生成环状核酸分子：除了图1A至D中所示的分子外，图12和13还显示了环状分子。在图12中，例如，通过使用转座酶，可以通过将dsDNA分子1206插入1205中来产生1209。在一个实施方案中，1206是通过使用引物1207黑色矩形和1208白色矩形产生的PCR产物。在另一个实施方案中，1206是与包含区段1207和1208的衔接子连接的DNA片段。1207和1208可包含转座酶识别序列。1207可包含切口核酸内切酶识别位点以在1209中产生切口，其具有适于引发RCA的可延伸的3'末端。能够在插入物1206内但不是1205内产生可延伸的3'末端允许在1209构建体中起始RCA并且防止不需要的没有插入物的1205参与RCA。1208可包含切口核酸内切酶识别位点以参与图2A的切口步骤d，从而促进脱支。在其他实施方案中，步骤d中使用的切口核酸内切酶识别位点可以存在于1209内的任何位置。在许多实施方案中，用于起始RCA或从切口步骤d开始进行脱支的切口核酸内切酶识别位点图2A可以存在于1206内的任何位置。优选的是，如果在1209内存在多于一个切口核酸内切酶识别位点以参与图2A中的步骤d，这样的切口识别位点被定向成使得切口出现在相同的链中而不是出现在1209的两个链中。在其他实施方案中，环状ssDNA构建体如图13中所示的1312用作RCA的模板[步骤a到c；图2A]。例如，可以通过包含链1310和1311的dsDNA分子产生1312，其产生单链1310通过使用例如变性或核酸外切酶介导的消化，其可以通过使用连接酶例如CircLigaseEpicentre或夹板连接自身连接，如本文其他地方所述。dsDNA分子可以是通过使用由黑色和白色矩形描绘的引物产生的PCR产物。在另一个实施方案中，dsDNA分子是与衔接子连接的DNA片段。引物之一或诸如dsDNA分子中的衔接子之一可以包含参与图2A步骤d的切口核酸内切酶识别位点。在其他实施方案中，这种切口核酸内切酶识别位点可以存在于1312内的任何位置，从而可以在图2A步骤d期间产生切口，在1312或其在RCA期间产生的互补链中。优选的是，在1312中存在多于一个切口核酸内切酶识别位点的情况下，这样的切口识别位点被定向成使得步骤d中的切口发生在1312或其互补链中，但不是两者中。实施例2使用发夹二聚体构建体的脱支实验：将20μl溶液——其包含2μlCutSmart10x缓冲液和4μl平端发夹衔接子100μM，所述衔接子具有序列：SEQ.ID.1:5PhosCTCACACACTTTTTTTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATTTCCTCAGCTTTTGTGTGTGAG——在95℃下温育2分钟以变性衔接子，然后静置冷却在室温，以促进发夹衔接子的自退火。将20μl快速连接酶缓冲液2x和2μl快速连接酶新英格兰生物实验室加入到发夹衔接子溶液，并在25℃下温育2小时，以产生环形构建体发夹二聚体，然后在65℃下10分钟以灭活连接酶。滚环扩增RCA：将40μl包含4μlCutSmart10x缓冲液NewEnglandBiolabs的反应液，2μl包含环形构建体发夹二聚体的连接反应液，1μldNTP每种25mM，1μlPrimPolSygnis；Expedeon和1μlphi29DNA聚合酶约100个单位Sygnis；Expedeon在30℃下温育1小时，然后在65℃下持续10分钟。将RCA的10μl等分试样加入1μlT7内切核酸酶I10个单位；NewEnglandBiolabs，并在37℃下温育1小时。将反应物在1％琼脂糖凝胶上运行参见图14，第1凝胶；泳道1：标记物；泳道2：T7核酸内切酶I处理的样品。将另一个10μl等分试样加入1μlNt.BbvCI10个单位；NewEnglandBiolabs中，并在37℃下温育1小时，然后在80℃下20分钟以灭活切口酶。将含有2μlThermoPolII10xNewEnglandBioLabs、0.5μldNTP25mMeach和0.5μlTaq聚合酶5单位；NewEnglandBioLabs的20μl加入到反应中，并在68℃下温育1小时。然后，将3μlNb.BbvCI30个单位；NewEnglandBiolabs加入，并将反应在37℃下温育1小时，然后在80℃下20分钟以灭活切口酶，最后在68℃下1小时以通过Taq聚合酶进行最后的延伸步骤。然后将反应准备好与衔接子连接以进行纳米孔测序。该方法的一个主要优点是它是单管方案，不需要在酶促反应之间进行纯化。另一个10μl的RCA反应的等分试样用作阴性对照，并且在37℃下温育1小时，然后在80℃下20分钟，但不添加切口酶。接着，如上述，加入20μlTaq聚合酶反应但不是Nb.BbvCI，并且如指示的温育。如图14所示，用切口酶和基于聚合酶的延伸脱链，设法产生长达3kb的长脱支DNA片段，而基于T7核酸内切酶I的脱支主要产生短片段迪米特拉·柴瓦希杜构建核酸分子拷贝的方法2018TSAV0121US62450,0702017-01-24US62451,7342017-01-29US62473,7002017-03-20US62506,7062017-05-16US62516,2632017-06-07US62576,9742017-10-25US62576,9922017-10-251PatentInversion3.5159DNA人工序列（ArtificialSequence）Adaptor（衔接子）1ctcacacactttttttgagagagagagagagagagatttcctcagcttttgtgtgtgag59

权利要求：1.一种构建包含核酸分子拷贝的脱支构建体的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i通过将核酸分子连接至至少一个衔接子来使其环化，所述衔接子包含至少一个切口内切核酸酶识别位点的至少一部分；ii进行滚环扩增；iii暴露于识别所述识别位点的切口内切核酸酶，使得仅在ii中产生的构建体的双链区的一侧产生切口；和iv暴露于包含5'-3'外切核酸酶和或活瓣内切核酸酶活性的聚合酶。2.根据权利要求1所述的方法，还包括直接进行步骤iv中产生的构建体连接至适合于测序的衔接子。3.一种构建核酸分子拷贝的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i进行滚环扩增；ii用溶解酶脱支，从而溶解三元连结体和其他分支产物；和iii用包含5'-3'外切核酸酶活性的聚合酶和或连接酶处理，从而使带切口、有缺口或含活瓣的产物免于进一步降解。4.一种产生包含环状核酸分子拷贝的脱支构建体的方法，所述环状核酸分子包含含有至少一个片段的链，所述片段具有在所述链的所述区段与具有与所述区段的所述序列互补的序列的另一区段退火的情况下可被序列特异性切口内切核酸酶识别的序列，所述序列不具有存在于所述链中的其互补序列，所述方法应用于一个或多个环状核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i将所述环状核酸分子暴露于包含核苷酸和链置换聚合酶的反应溶液，以产生包含所述环状核酸分子的多个拷贝的分支构建体；和ii通过包括以下步骤脱支所述分支构建体：a暴露于识别所述序列的切口内切核酸酶，从而在所述分支构建体上产生切口；和b暴露于包含5'-3'外切核酸酶和或活瓣核酸酶活性的聚合酶，以在a中产生的切口延伸3'末端，从而产生脱支的双链构建体。5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤在单管反应中进行。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子通过以下构建：i将双链核酸分子暴露于反应溶液中，所述反应溶液包含外切核酸酶分子以消化所述核酸分子的一条链但不消化另一条链；和ii将步骤i中未消化的链暴露于单链特异性连接酶，从而形成环状分子。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子由双链核酸分子构建，所述双链核酸分子包含至少一条链，所述链包含至少两个彼此至少部分互补的区段，并且所述方法还包括：i将双链核酸分子暴露于反应溶液中，所述反应溶液包含外切核酸酶分子以消化所述核酸分子的一条链，使另一条链保持完整，所述另一条链包含至少两个彼此至少部分互补的区段；ii通过使所述至少两个彼此至少部分互补的区段退火，允许所述另一条链形成发夹；和iii将步骤ii中的发夹连接到发夹衔接子上，从而形成环状核酸分子。8.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子通过以下构建：i将双链核酸分子暴露于反应溶液中，所述反应溶液包含外切核酸酶分子以消化所述核酸分子的一条链但不消化另一条链；和ii将步骤i中未消化的链暴露于包含连接酶和适用于夹板连接的寡核苷酸的溶液中。9.根据权利要求4所述的方法，其中所述环状核酸分子通过以下构建：i使双链核酸分子变性，从而产生单链；和ii将步骤i中的单链暴露于包含连接酶和适用于夹板结扎的寡核苷酸的溶液中。10.一种构建环状DNA单链的脱支拷贝的方法，所述环状DNA单链包含至少一个位点，所述位点在所述位点变为双链的情况下可被序列特异性切口内切核酸酶识别，所述位点不存在于与所述环状DNA单链完全互补的任何序列中，所述方法应用于一个或多个环状DNA单链，并且所述方法包括以下步骤：i将所述环状DNA单链暴露于包含核苷酸和链置换聚合酶的反应溶液中，以产生包含所述环状DNA单链的多个拷贝的分支构建体；和ii通过包括以下步骤脱支所述分支构建体：a暴露于识别所述环状DNA单链内位点的切口内切核酸酶，从而在所述分支构建体上产生切口，所述切口在所述分支构建体中的一条或多条链中产生，但不在所述一条或多条链的互补链中产生；和b暴露于包含5'-3'外切核酸酶和或活瓣核酸酶活性的聚合酶，以在a中产生的切口处延伸3'末端，从而产生脱支的双链构建体。11.一种构建双链核酸分子的一条链的拷贝的方法，所述核酸分子在其5'末端包含相似序列的区段，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括步骤：i将所述核酸分子暴露于外切核酸酶分子以消化所述核酸分子的一条链而不消化另一条链；ii允许步骤i中未被消化的链自身退火或由于互补性与另一条链退火，这归因于双链核酸分子的5'末端的相似的区段序列；iii使步骤ii的退火产物与发夹衔接子连接，从而形成环状分子；和iv使步骤iii中的环状分子进行滚环扩增。12.根据权利要求11所述的方法，还包括直接进行步骤iib中产生的构建体连接至适合于测序的衔接子。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述环状核酸分子包含一个或多个可被序列特异性切口内切核酸酶识别的位点，所述位点负责在步骤iia期间引起切口，所述切口在步骤i中存在于所述分支构建体中的一条或多条链中但不存在于它们的互补链中；i允许步骤i中未被消化的链自身退火或由于互补性与另一条链退火，这是由于双链核酸分子的5'末端的相似的区段序列；ii使步骤ii的退火产物与发夹衔接子连接，从而形成环状分子；和iii使步骤iii中的环状分子进行滚环扩增。14.一种构建核酸分子拷贝的方法，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i将核酸分子转化为环状分子；ii对所述环状分子进行滚环扩增，得到包含环状分子拷贝的单链产物；iii切割在步骤ii中的环状分子而不切割单链产物，从而产生可延伸的3'末端；和iv延伸步骤iii中的3'末端以将步骤ii中的单链产物转化为双链。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸分子包含至少一个可切割特征。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸分子通过连接到发夹衔接子而环化，所述发夹衔接子包含至少一个可切割的特征。17.根据权利要求14所述的方法，其中同时执行至少两个步骤。18.根据权利要求14所述的方法，其中所述环状分子包括至少一个捕获特征。19.一种构建环状核酸分子的脱支拷贝的方法，所述环状核酸分子包含至少一个可被序列特异性切口内切核酸酶识别的位点，所述方法应用于一种或多种核酸分子，并且所述方法包括以下步骤：i将所述环状核酸分子暴露于包含核苷酸和链置换聚合酶的反应溶液中以产生包含多个拷贝的所述环状核酸分子的分支构建体；和ii通过包括以下步骤来脱支所述分支构建体：a暴露于识别所述环状核酸分子内位点的切口内切核酸酶，从而在所述分支构建体上产生切口；和b暴露于包含5'-3'外切核酸酶和或活瓣核酸酶活性的聚合酶，以在a中产生的切口处延伸3'末端，从而产生脱支的双链构建体。20.根据权利要求19所述的方法，还包括直接进行步骤iib中产生的构建体连接至适合于纳米孔测序的衔接子。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述环状核酸分子是具有或不具有自身互补区域的单链，并且所述可被序列特异性切口内切核酸酶识别的位点不存在于与所述环状核酸分子完全互补的任何序列中。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述环状核酸分子包含一个或多个可被序列特异性切口内切核酸酶识别的位点，所述位点负责在步骤iia期间引起切口，所述切口在步骤i中存在于所述分支构建体中的一条或多条链中但不存在于它们的互补链中。

百度查询： 瓦斯特根公司 构建核酸分子拷贝的方法