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申请/专利权人：山东大学

摘要：本发明属于基因工程技术领域，具体涉及PD‑L1和HBx靶基因沉默RNA双表达载体在抑制HBV感染中的应用。与单功能载体相比，本发明构建得到的pSIREN‑shPD‑L1‑shHB对HepG2.2.15细胞增殖的抑制效果更好，对细胞凋亡也有更好地促进作用，通过WesternBlot检测胞内抗凋亡蛋白表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl‑2和Bcl‑xl的表达，定量PCR检测胞内抗凋亡蛋白基因表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl‑2和Bcl‑xl的mRNA表达。

主权项：1.一种双功能载体在制备抑制HBV感染的药物中的应用，其特征在于，靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体；PD-L1和HBx的RNAi双功能载体的构建方法，包括以下步骤：1将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的PD-L1siRNA和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的HBxsiRNA序列串联成长发卡结构，并在序列两端添加双酶切位点BamHI和EcoRI序列，退火形成lhRNA双链结构；2将pSIREN载体进行BamHI和EcoRI双酶切，并回收载体骨架，得pSIREN线性载体；3将步骤1制得的串联的lhRNA与2制得的pSIREN线性载体连接，构建成pSIREN-shPD-L1-shHBx质粒，即得。

全文数据：_种双功能载体在抑制HBV感染中的应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及ro-Ll和HBx靶基因沉默RNA双表达载体在抑制HBV感染中的应用。背景技术[0002]乙型肝炎病毒HepatitisBvirus，HBV最早被鉴定于1966年，是一种主要经过消化道或血液等体液途径传播的嗜肝性DNA病毒。慢性HBV感染是导致肝炎、肝硬化以及肝癌的一个重要原因。[0003]RNA干扰RNAinterference，RNAi，是指由小非编码RNA诱导mRNA降解、翻译抑制或促使异染色质形成等，进而沉默基因表达，产生相应的功能表型缺失的现象。该技术的诞生使得人们可以根据自己的需要高效、特异地沉默病毒mRNA，从而抑制病毒抗原产生，为病毒感染及相关疾病治疗提供了一柄利器。HBV是目前己知的感染人类最小的双链DNA病毒，但由于具有重复的基因序列，故其基因排列紧密，利用率高，能够编码病毒生存需要的多种成分，同时，HBV在自我复制过程中是利用自身pgRNA前基因组RNA来逆转录合成DNA。所以RNAi不仅可以沉默靶向HBV基因抑制其蛋白表达，也可以沉默HBVpgRNA抑制病毒复制，故慢性HBV感染适合于RNAi技术治疗。[0004]另外，T细胞在HBV感染中发挥着至关重要的抗病毒作用，但是在HBV慢性感染患者体内，T细胞的功能低下并且趋于凋亡，呈现一种耗竭的状态。研宄发现，与健康人相比，CHB病人肝细胞表面的共抑制性分子ro-Li表达明显上调，并且，大量研究发现，利用阻断性抗体阻断PD-L1PD-1信号通路可以逆转CD8+T细胞功能的耗竭和增强机体抗病毒能力。因此，利用RNAi干扰技术对该免疫检查点分子的靶向治疗可能会为我们在抗HBV治疗中带来新的曙光。发明内容[0005]本发明的目的是，通过构建PD-L1和HBx靶基因沉默RNA双表达载体，转染被病毒感染的细胞后既能沉默病毒自身成分抑制其生命周期，又能沉默宿主表面的免疫抑制分子来增强机体的抗病毒免疫反应，进而对慢性HBV病毒感染起到有效的治疗。[0006]为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：[0007]本发明提供一种双功能载体在抑制rov中的应用，所述双功能载体靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体。[0008]本发明通过实验证明，与单功能载体组相比，双功能载体对细胞增殖的抑制效果更好，通过WesternBlot检测胞内信号通路蛋白的变化，发现双功能载体组能明显下调P-mTOR蛋白的表达；与单功能载体组相比，双功能载体对细胞凋亡有更好地促进作用，通过WesternBlot检测胞内抗凋亡蛋白表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl-2和Bcl-x1的表达，定量PCR检测胞内抗凋亡蛋白基因表达情况，发现双功能载体组能明显下调Be1_2和Bel-xl的mRNA表达。附图说明[0009]图1为筛选沉默效果较好的PD-L1siRNA序列；其中：CTRL组为未加入转染试剂和siRNA组Lip〇2〇00为只加入转染试剂组；I，2,3为PD-L1的SEQIDN0.1，SEQIDNO.2和SEQIDN0_3所示的三条siRNA转染组。[0010]图2为HBxsiRNA沉默效果的基因水平验证图，其中：CTRL组为未加入转染试剂和siRNA组，Lipo2000为只加入转染试剂组，HBXsiRNA为siRNA转染组。图3为HBxsiRNA沉默效果的蛋白水平验证图，其中：CTRL组为未加入转染试剂和siRNA组，Lipo2000为只加入转染试剂组，HBxsiRNA为siRNA转染组。[0012]图4为构建的单双功能载体对HBx沉默效果的基因水平，其中：lip〇2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-Ll为pSIREN-shPD-Ll载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-Ll-shHBx双功能载体转染组。[0013]图5为构建的单双功能载体对HBx沉默效果的基因水平;其中：lip〇2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-Ll为pSIREN-shPD-Ll载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-Ll-shHBx双功能载体转染组。[0014]图6为构建的单双功能载体对HBx沉默效果的蛋白水平验证;其中：lip〇2〇〇〇为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-Ll为pSIREN-shPD-Ll载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-Ll-shHBx双功能载体转染组。[0015]图7为构建的单双功能载体对HBx沉默效果的基因水平蛋白水平验证，其中：lip〇2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-Ll为pSIREN-shPD-Ll载体转染组，Dual为pSIREN-shTO-Ll-shHBx双功能载体转染组。[0016]图8为双表达载体能够抑制ItepG2•2•15细胞的增殖;其中：lipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-Ll为pSIREN-shPD-Ll载体转染组，Dual为pSIREN-shro-Ll-shHBx双功能载体转染组。[0017]图9为双表达载体能够下调胞内增殖相关的信号通路蛋白；其中：lip〇2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-Ll为pSIREN-shPD-Ll载体转染组，Dual为pSIREN-shPD-Ll-shHBx双功能载体转染组。[0018]图10为双表达载体能够促进HepG2•2•15细胞的凋亡；其中：1ipo2000为只加入转染试剂组，Vector为空载体转染组，shHBx为pSIREN-shHBx载体转染组，shPD-Ll为pSIREN-shPD-Ll载体转染组。[0019]图11为双表达载体能够明显下调胞内抗凋亡蛋白蛋白水平的图。[0020]图12为双表达载体能够明显下调胞内抗凋亡蛋白基因水平的图。具体实施方式[0021]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0022]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和或它们的组合。[0023]本发明提供一种双功能载体在抑制HBV中的应用，所述双功能载体为靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体。[0024]进一步地，所述双功能载体在抑制细胞生长中的应用。[0025]进一步地，所述双功能载体在改变细胞内信号通路方面中的应用。[0026]进一步地，所述双功能载体在促进细胞凋亡中的应用。[0027]进一步地，PD-L1基因的特异性沉默siRNA核苷酸序列如SEQIDN0.1，SEQIDN0.2和SEQIDN0_3所示。在本发明最佳技术方案中，选择的人源的PD-L1基因的特异性沉默siRNA序列为SEQIDNO.1所示序列[0028]更进一步地，所用载体为pSIREN。[0029]进一步地，HBxsiRNA核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。[0030]所述PD-L1和HBx的RNAi双功能载体的构建方法，包括以下步骤：[0031]1将核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的PD-LlsiRNA和核苷酸序列如SEQIDN0.4所示的HBxsiRNA序列串联成长发卡结构，并在序列两端添加双酶切位点BamHI和EcoRI序列，退火形成lhRNA双链结构；[0032]2将pSIREN载体进行BamHI和EcoRI双酶切，并回收载体骨架，得pSIREN线性载体；[0033]3将步骤步骤⑴制得的串联的lhRNA与⑵制得的pSIREN线性载体连接，构建成pSIREN-shF*D-Ll-shHBx质粒，即得。[0034]进一步地，所述靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体的构建方法中步骤1lhRNA核苷酸序列如SEQIDNO.5〜6所示。[0035]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。[0036]实施例1人源的PD-L1基因的特异性沉默siRNA序列的筛选[0037]针对人源PD-L1基因的序列，设计针对人源的PD-L1基因的特异性沉默siRNA，序列分别如3601〇勵.1，5£010吣.2和8£010^.3所示。[0038]利用阳离子脂质体Lipofectamine2000购自invitrogen将设计的上述siRNA转染到表达PD-L1水平较高的的人脑胶质瘤细胞系U251细胞中，通过qPCR技术检测PD-L1基因的表达水平，结果见图1所示。由图1可知，序列为SEQIDNO.1所示的siRNA沉默效果最好，因此筛选SEQIDNO.1所示的PD-LlsiRNA序列做进一步功能研究。[0039]实施例2—种HBxsiRNA序列[0040]所述HBxsiRNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。[0041]利用阳离子脂质体Lipofectamine2000将合成的HBxsiRNA转染到HBV感染的人肝细胞系HepG2.2.15细胞，并通过qPCR和WesternBlot技术检测HBx基因和蛋白的表达水平，结果如图2所示。由图2可知，所述siRNA序列对HBx基因和蛋白的表达均具有较好的沉默效果。[0042]实施例3—种靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体的构建方法[0043]所述靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体的构建方法，包括以下步骤：[0044]⑴将核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的PD-LlsiRNA和核苷酸序列如SEQIDN0.4所示的HBxsiRNA序列串联成长发卡结构，并在序列两端添加双酶切位点BamHI和EcoRI序列，退火形成lhRNA双链结构，h-shPD-Ll-shHBx-F核苷酸序列如SEQIDN0.5所示;h-shPD-11-311邢1-財亥苷酸序列如5£010从.6所示；[0045]⑵将pSIREN载体进行BamHI和EcoRI双酶切，并回收载体骨架，得pSIREN线性载体；[0046]⑶将步骤步骤⑴制得的串联的lhRNA与⑵制得的pSIREN线性载体连接，构建成pSIREN-shPD-Ll-shHBx质粒，即得。[0047]对比例1单功能表达载体的构建[0048]所述单功能载体的构建方法，包括以下步骤：[0049]1将核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的PD-L1siRNA和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的ffflxsiRNA序列两端添加双酶切位点BamHI和EcoRI序列，退火形成shRNA双链结构，h-shPD-Ll-F核苷酸序列如SEQIDN0.7所示；h-shPD-Ll-R核苷酸序列如SEQIDNO.8所示;HBx-F核苷酸序列如SEQIDNO.9所示;tfflx-R核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；[0050]2将pSIREN载体进行BamHI和EcoRI双酶切，并回收载体骨架，得pSIREN线性载体；[0051]⑶将步骤步骤⑴制得的shRNA分别与（2制得的pSIREN线性载体连接，构建成pSIREN-shHBx单功能表达载体，pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体。[0052]试验例1双沉默载体沉默效果的验证[0053]一）定量PCR[0054]1pSIREN-shHBx单功能表达载体和pSIREN-shro-Ll-shHBx双功能表达载体转染HepG2.2.15细胞24h后，提取RNA，检测HBVx基因，能够看到单功能表达载体和双功能表达载体相比于空载体，均具有良好沉默作用如图4所示）；[0055]2pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体和PSIREN-shPD-Ll-shHBx双功能表达载体转染HepG2•2•15细胞24h后，提取RNA，检测H-L1基因，能够看到单功能表达载体和双功能表达载体相比于空载体，均具有良好沉默效果如图5所示）。[0056]二WesternBlot[0057]pSIREN-shHBx单功能表达载体和pSIREN-shPD-Ll-shHBx双功能表达载体转染HepG2•2•15细胞4池后，提取细胞全蛋白，检测HBVx蛋白表达，能够看到单功能表达载体和双功能表达载体相比于空载体，均具有良好沉默效果如图6所示）。[0058]三流式细胞术[0059]pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体和pSIREN-shPD-Ll-shHBx双功能表达载体转染HepG2•2.15细胞48h后，收集细胞，流式仪检测细胞表面PD-L1表达，能够看到单功能表达载体和双功能表达载体相比于空载体，均具有良好沉默效果如图7所示）。[0060]试验例2双沉默载体对HepG2•2•15细胞生长的影响[0061]1将pSIREN空载体，pSIREN-shHBx单功能表达载体，pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体和pSIREN-shPD-Ll_shHBx表达载体转染HepG2.2.15细胞12h后，将细胞以每孔6〇〇0个铺到九十六孔板中，三天后检测细胞活力。可以看到，与单功能载体组相比，双功能载体对细胞增殖的抑制效果更好如图8所示）。[0062]⑵将PSIREN空载体，pSIREN-shHBx单功能表达载体，pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体和pSIREN-shPD-Ll-shHBx表达载体转染H印G2•2•15细胞48h后，收集细胞，提取胞内全蛋白，WesternBlot检测胞内信号通路蛋白的变化，发现双功能载体组能明显下调mTOR蛋白的活化如图9所示）。[0063]试验例3双沉默载体对IfepG2•2•15细胞凋亡的影响[0064]1将pSIREN空载体，pSIREN-shHBx单功能表达载体，pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体和pSIREN-shPD-Ll-shHBx表达载体转染IfepG2•2•I5细胞24h后，检测细胞的凋亡情况，可以看到，与单功能载体组相比，双功能载体对细胞凋亡有更好地促进作用如图10所示）。[0065]⑵将pSIREN空载体，pSIREN-shHBx单功能表达载体，pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体和pSIREN-shro-Ll-shHBx表达载体转染H印G2•2•15细胞4池后，收集细胞，提取胞内全蛋白，WesternBlot检测胞内抗凋亡蛋白表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bel-2和Bcl_xl的表达如图11所不）。[0066]⑶将pSIREN空载体，pSIREN-shHBx单功能表达载体，pSIREN-shPD-Ll单功能表达载体和pSIREN-shPD-Ll-sWfflx表达载体转染H印G2•2•I5细胞24h后，收集细胞，提取RNA，定量PCR检测胞内抗凋亡蛋白基因表达情况，发现双功能载体组能明显下调Bcl_2和Bcl_xl的mRNA表达如图12所示）。

权利要求：1.一种双功能载体在抑制HBV感染中的应用，其特征在于，靶向于PD-L1和HBx的RNAi双功能载体。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双功能载体在抑制细胞生长中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双功能载体在改变细胞内信号通路方面中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，双功能载体在促进细胞凋亡中的应用。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，PD-L1基因的特异性沉默siRNA核苷酸序列如8£〇10购.1，3£〇10恥.2和3£〇10从.3所示。6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所用表达载体为PSIREN。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，HBxsiRNA核苷酸序列如SEQIDN0_4所7J\〇8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，PD-L1和HBx的RNAi双功能载体的构建方法，包括以下步骤：一⑴将核苷酸序列如SEQIDN0.1所示的PD-LlsiRNA和核苷酸序列如SEQIDN0.4所示的HBxsiRNA序列串联成长发卡结构，并在序列两端添加双酶切位点BamHI和EcoRI序列，退火形成lhRNA双链结构；2将pSIREN载体进行BamHI和EcoRI双酶切，并回收载体骨架，得PSIREN线性载体；3将步骤步骤（1制得的串联的lhRNA与（2制得的PSIREN线性载体连接，构建成pSIREN-shPD-Ll-shHBx质粒，即得。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（1lhRNA核苷酸序列如SEQIDNO.5〜6所示。

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