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申请/专利权人：南华大学附属第一医院;中南大学

摘要：本发明涉及一种3D人脑类器官培养方法，包括a培养多能干细胞以获得类胚体；b对来自a的所述类胚体进行神经诱导；c对来自b的神经诱导后的类胚体进行神经分化；d对来自c的神经分化后的类胚体进行培养，以获得3D人脑类器官；其特征在于，培养多能干细胞分成两个阶段，第一阶段的培养基包含ROCK抑制剂；第二阶段的培养基包含SMAD抑制剂、巨噬细胞集落刺激因子和细胞因子。本发明培养了一种含有胶质细胞的3D人脑类器官，并且培养过程类似生理状态下神经系统中小胶质细胞的形成过程，可为研究神经系统发育过程和神经免疫相关疾病（阿尔茨海默症、帕金森病等）提供可靠、有效的体外研究模型。

主权项：1.一种包含胶质细胞的3D人脑类器官的培养方法，包括以下步骤：a培养多能干细胞以获得类胚体；b对来自a的所述类胚体进行神经诱导；c对来自b的神经诱导后的类胚体进行神经分化；d对来自c的神经分化后的类胚体进行培养，以获得3D人脑类器官；其特征在于，步骤（a）培养多能干细胞获得类胚体分成两个阶段；第一阶段的培养基即第一培养基，由基础培养基和第一特异性添加因子组成；所述第一特异性添加因子由以下终浓度的组分组成：血清替代物，10％-20％；成纤维细胞生长因子，4-8ngml；谷氨酰胺补充剂，1-2x；非必需氨基酸补充剂，1-2x；抗生素，1-2x；ROCK抑制剂Y27632，20-30μM；第二阶段的培养基即第二培养基，由基础培养基和第二特异性添加因子组成；所述第二特异性添加因子由以下终浓度的组分组成：血清替代物，10%-20%；成纤维细胞生长因子，4-8ngml；谷氨酰胺补充剂，1-2x；非必需氨基酸补充剂，1-2x；抗生素，1-2x；巨噬细胞集落刺激因子M-CSF，10ngml；细胞因子IL-34，100ngml；SMAD抑制剂SB431542，10μM；SMAD抑制剂LDN19318，200nM；步骤b采用第三培养基培养所述自a的所述类胚体；所述第三培养基由基础培养基和第三特异性添加因子组成；所述第三特异性添加因子由以下终浓度的组分组成：成纤维细胞生长因子，4-8ngml；谷氨酰胺补充剂，1-2x；非必需氨基酸补充剂，1-2x；抗生素，1-2x；用于细胞增殖的补充剂肝素，1μgml；用于扩增未分化细胞的补充剂N2，1-2x；SMAD抑制剂SB431542，10μM，SMAD抑制剂LDN193189，200μM；步骤（c）采用第四培养基培养来自b的神经诱导后的类胚体；所述第四培养基由基础胚胎神经元细胞生长培养基和第四特异性添加因子组成；所述第四特异性添加因子由以下终浓度的组分组成：谷氨酰胺补充剂，1-2x；非必需氨基酸补充剂，1-2x；抗生素，1-2x；用于扩增未分化细胞的补充剂N2，0.5％-1％；用于维持神经元的补充剂B27，1％-2％；胰岛素，2.5-3.5μgml；步骤d采用第五培养基培养来自c的神经分化后的类胚体；所述第五培养基由基础胚胎神经元细胞生长培养基和第五特异性添加因子组成；所述第五特异性添加因子由以下终浓度的组分组成：谷氨酰胺补充剂，1-2x；非必需氨基酸补充剂，1-2x；抗生素，1-2x；用于扩增未分化细胞的补充剂N2，0.5％-1％；用于维持神经元的补充剂B27，1％-2％；胰岛素，2.5-3.5μgml；脑源性神经营养因子BDNF，10-20ngml；胶质细胞源性神经生长因子GDNF，10-20ngml；cAMP激活剂，10-20μM；抗坏血酸，200-300μM。

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