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申请/专利权人：武汉市农业科学院

摘要：本发明提供了一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的检测方法。该方法适用于监控奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素残留量，采用弱阳离子交换固定相作为萃取小柱填料，有效去除背景基质带来的干扰，提高了方法的灵敏度，本发明的方法对丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的最低检出限为0.12μgmL、0.52μgmL、0.96μgmL、0.18μgmL和1.87μgmL，完全满足国家标准的限量要求。而且本发明提供的检测方法无需流动相中添加盐和离子对试剂，有效避免了质谱仪器被污染的情况，检测效率高，简单方便，且耗时短。

主权项：1.一种奶牛循环养殖中氨基糖苷类抗生素的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、样品前处理：所述样品前处理的具体方法为：称取2g样品，加入超纯水10mL，振荡30min，然后在6000转速下离心10min，取第一上清液5mL；向第一上清液加入200μL50%的三氯乙酸水溶液（wv），用力振荡混匀，然后于高速离心机中10000rpm离心5min，取第二上清液2.5mL；向第二上清液中加入适量2MNaOH水溶液调节pH值至6-7，离心，取第三上清液，待用；所述样品为牛尿、牛奶、牛粪和饲料中的任一种；S2、固相萃取：先用3mL甲醇，3mL水活化TGA固相萃取小柱，活化后将步骤S1中的第三上清液全部上样；上样结束后采用3mL5mM乙酸铵水溶液、3mL5mM乙酸铵-甲醇水溶液，所述5mM乙酸铵与甲醇水溶液的体积比为20：80、3mL5mM乙酸铵水溶液依次淋洗，所述的5mM乙酸铵用乙酸调节pH为4.8；淋洗结束后减压抽干1~2min，最后采用3mL甲酸-乙腈-水混合溶液洗脱，其中甲酸、乙腈、水的体积比为2:40:60，收集洗脱液，涡旋混匀，经0.22μm滤膜过滤，即为待测样品；S3、标准工作溶液配制：将空白样品按上述步骤S1和S2处理得到空白样品基质溶液，用空白样品基质溶液在0～1000μgmL范围内，配制至少五个浓度的氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液；所述氨基糖苷类抗生素混合标准工作溶液为含丁胺卡那霉素、链霉素、安普霉素、卡那霉素和妥布霉素的混合标准工作溶液；S4、高效液相色谱串联质谱LC-MSMS测定：液相色谱条件：色谱柱为XbridgeBEHC182.1×50mm，2.5µm；流动相A为含0.1%甲酸的10mmolL甲酸铵溶液；流动相B为甲醇；流速为0.5mLmin；进样量为5μL；柱温为30℃；等度洗脱程序为以流动相A和流动相B的体积比例为98：2洗脱10min；质谱条件：离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描；检测方式为多重反应监测；毛细管电压为3.2kV；离子源温度为150℃；去溶剂气温度为500℃；去溶剂气流量：800L／h；锥孔气流速为150Lh；碰撞气流速为0.13mLmin；质谱检测使用多反应监测扫描模式，丁胺卡那霉素的母离子586.2，子离子分别为323.9和425.0；链霉素的母离子582.2，子离子分别为263.7和407.7；安普霉素的母离子540.2，子离子分别为217.0和378.0；卡那霉素的母离子485.2，子离子分别为162.8和324.0；妥布霉素的母离子468.2，子离子分别为163.0和205.1；S41、定量测定：将步骤S3中混合标准工作溶液进行LC-MSMS测定，以混合标准工作溶液的峰面积为纵坐标，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，进行回归分析，绘制标准曲线，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤S2中的待测样品注入LC-MSMS进行测定，测得待测样品中各氨基糖苷类抗生素的色谱峰面积，代入标准曲线，得到待测样品中氨基糖苷类抗生素的含量，然后根据待测样品所代表试样的质量计算得到样品中氨基糖苷类抗生素的残留量；S42、定性测定：检测步骤S2中待测样品中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度偏差满足欧盟657指令的要求时，则判断该样品中存在该种目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物。

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