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申请/专利权人：杭州医美创新科技有限公司

摘要：本发明属于基因工程领域，更具体地公开了一种高活性重组人纤连蛋白及其制备方法和应用，通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。本发明提供的利用毕赤酵母作为表达宿主细胞，可以解决人工提取纤连蛋白量少并且生物活性低的技术缺陷。该重组人纤连蛋白能有效促进细胞粘附和增殖；可在食品、化妆品、保健品、药械等领域应用。本发明的提供的重组人纤连蛋白的制备方法基因序列稳定，表达量高，且制备的重组人纤连蛋白生物学活性高、纯度高。

主权项：1.一种高活性的重组人纤连蛋白，其特征在于，所述人纤连蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；编码所述人纤连蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述重组人纤连蛋白的制备方法包括以下步骤：（1）构建重组人纤连蛋白表达载体：人工合成SEQIDNo.3所示的重组人纤连蛋白核苷酸序列，在所述核苷酸序列的5’端和3’端分别加入Xho1和Xba1酶切位点，将获得的核苷酸序列和表达载体pPICZαA同时进行双酶切，并回收酶切产物，利用DNA连接酶将回收的目的产物进行连接，获得包含SEQIDNO.3的重组质粒pPICZαA-rFn；（2）重组质粒转染毕赤酵母GS115菌株：将10μg重组质粒pPICZαA-rFn与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，混合液转入0.2cm预冷的电转杯中，电击4-10毫秒，加入1mL冰预冷的1molL的山梨醇溶液并混匀液体，涂布在YPD培养基平板上，30℃倒置培养2天，待平板上长出单菌落，将使用序列SEQIDNO.3的表达菌命名为GS115pPICZαA-rFn；所述YPD培养基含有1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％琼脂粉以及Zeocin100μgml；（3）纤连蛋白的诱导表达：将上述构建的含重组质粒GS115pPICZαA-rFn菌株在LB固体培养基上划线，37℃培养12h；挑取单克隆至30mLLB液体培养基中，37℃、220rpm培养，OD600值达到0.8时，加入1mMIPTG进行诱导4h表达；分别取未诱导菌液、诱导完成的菌液取样1.5mL，4℃、12000×g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000×g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达情况；采用图像处理软件ImageJ对表达量进行分析，GS115pPICZαA-rFn表达量为42.8％；（4）纤连蛋白的发酵和蛋白的纯化：将含重组质粒GS115pPICZαA-rFn的菌株接种到1L、卡那霉素含量为50μgmL的LB培养基中进行摇瓶发酵并诱导；4℃、6000×g、10min离心收集菌体，然后将菌体沉淀按体积比1:10比例重新悬浮于NTA-10缓冲液，1000bar高压均质破碎细胞；4℃、25000×g、30min离心收集上清，上清上样至柱床体积为20mL的Ni-NTA亲和层析柱中，流速8mLmin，NTA-0缓冲液洗回基线，流速为1mLmin，NTA-40缓冲液洗杂蛋白，NTA-80缓冲液洗杂蛋白，NTA-250缓冲液洗脱目的蛋白；纯化后的纤连蛋白突变体蛋白经SephadexG-25分子筛脱咪唑以及3KDa的超滤管浓缩，即得SEQIDNo.1所示重组人纤连蛋白。

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