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申请/专利权人：杭州恩和生物科技有限公司

摘要：本发明提供一种类红球细菌接合转化方法，其包括以下步骤：1培养基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001；2转化靶标质粒进入所述基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001，得到含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001；3培养通过步骤2得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001至OD600为0.3～0.7；4培养类球红细菌至OD660为1.8～2.0；5将步骤3得到的含靶标质粒的基因缺陷型大肠杆菌SD1149‑001和步骤4得到的类球红细菌混合，进一步培养；6得到含有靶标质粒的类红球细菌。使用本发明的接合转化方法，避免了再次涂布分离大肠杆菌和类球红细菌，并且提高了接合转化效率，使得获得的类球红细菌单克隆菌株相比于其他条件提高至少3倍。

主权项：1.一种类红球细菌接合转化方法，其包括以下步骤：（1）制备大肠杆菌SD1149-001：所述大肠杆菌SD1149-001为将大肠杆菌ATCC47005的hemA基因敲除而获得的基因缺陷型改造菌株；（2）制备供体菌：大肠杆菌SD1149-001转化入靶标质粒，得到供体菌含靶标质粒大肠杆菌SD1149-001；（3）活化供体菌：用含有五胺基酮戊酸以及适当抗生素的SOB液体培养基两次活化培养步骤（2）获得的供体菌，至OD600为0.36～0.62；（4）活化受体菌：在固体培养基中避光培养受体菌类球红细菌二至三天；再接种至液体培养基进行光照隔夜培养；然后于光照条件下30℃培养受体菌至OD660为1.94；（5）接合转化：取步骤（3）得到的活化供体菌，用LB液态培养基清洗并重悬，使其吸光度OD600＝1.0；取步骤（4）得到的活化受体菌30mL用LB液态培养基清洗并重悬于2mLLB液态培养基中；等量所述重悬的供体菌和重悬的受体菌在多连管或多孔板中混合；室温下离心5分钟，于光照环境下30℃放置共培养24小时；将共培养所得的菌液涂布至不含五胺基酮戊酸的固体培养基平板上；所述多连管或多孔板为8连管、24孔板、96孔板或384孔板；（6）接合转化子获得：无需再次涂布分离大肠杆菌和类球红细菌，即得到含有靶标质粒的类红球细菌接合转化子。

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