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申请/专利权人：福州大学;清源创新实验室

摘要：本发明提供了一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D‑阿洛酮糖的方法。利用大肠杆菌JM109DE3为宿主，通过敲除基因fruA,mak,manXYZ，galE和经转录组测序筛选获得的D‑阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA，同时引入外源D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因dpe以及表达第34位碱基g突变为t的果糖非特异性转运蛋白基因ptsG‑F构建重组菌株JM109DE3DPE,PtsG‑F,ΔFruA,ΔMak,ΔManXYZ,ΔGalE，ΔFryA。对该重组菌株进行高低温转换的控温发酵和补料分批发酵实现D‑阿洛酮糖的高效合成。

主权项：1.一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：首先以大肠杆菌JM109DE3为宿主，敲除UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE，并引入核糖-5-磷酸异构酶基因rpi，构建重组菌株JM109DE3-RPIΔGalE，使用含D-阿洛酮糖的LB培养基对重组菌株JM109DE3-RPIΔGalE进行驯化培养，以提高重组菌株中D-阿洛酮糖内转运蛋白的表达量，之后进行转录组测序分析，筛选出大肠杆菌的D-阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA；随后在大肠杆菌JM109DE3中敲除果糖特异性PTS多磷酸化转运蛋白基因fruA，果糖激酶基因mak，甘露糖特异性PTS转运蛋白基因manXYZ，UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE，以及D-阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA，共5个基因，并引入D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因dpe和果糖非特异性转运蛋白基因ptsG-F，构建重组菌株JM109DE3-DPEPtsG-FΔFruAΔMakΔManXYZΔGalEΔFryA，该重组菌株通过控温发酵，最终实现D-阿洛酮糖的高效合成；所述的基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：（1）以大肠杆菌JM109DE3为宿主，敲除UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因galE，并引入核糖-5-磷酸异构酶基因rpi，构建重组菌株JM109DE3-RPIΔGalE；通过在LB培养基中添加D-阿洛酮糖对重组菌株JM109DE3-RPIΔGalE进行驯化培养，后经转录组测序分析，筛选出D-阿洛酮糖的内转运蛋白关键基因fryA；（2）将大肠杆菌JM109DE3中的fruA,mak,manXYZ,galE和fryA基因敲除，并表达dpe和ptsG-F基因，得到重组菌株JM109DE3-DPEPtsG-FΔFruAΔMakΔManXYZΔGalEΔFryA；（3）在步骤（2）得到的重组菌株JM109DE3-DPEPtsG-FΔFruAΔMakΔManXYZΔGalEΔFryA的基础上，根据外源基因dpe的体外酶催化实验，确定D-果糖合成D-阿洛酮糖转化率最高的温度，同时结合大肠杆菌耐热性实验，获得重组大肠杆菌JM109DE3-DPEPtsG-FΔFruAΔMakΔManXYZΔGalEΔFryA由高温状态49℃切换为低温状态30℃，细胞正常生长；（4）重组菌株JM109DE3-DPEPtsG-FΔFruAΔMakΔManXYZΔGalEΔFryA通过摇瓶温控及发酵罐分批补料发酵，实现发酵法高转化率及高得率合成D-阿洛酮糖；步骤（1）所述的D-阿洛酮糖蛋白关键基因fryA的基因序列如SEQIDNO.1所示；步骤（1）中所述核糖-5-磷酸异构酶基因rpi来自热纤维梭菌（Clostridiumthermocellum），GenBank序列号为ABN53797.1；步骤（2）中大肠杆菌JM109DE3敲除的基因fruA,mak和galE的NCBI序列号分别为NP_416672.1,NP_414928.2和NP_415280.3，ManXYZ是三个基因的组合，NCBI序列号分别为NP_416331.1,NP_416332.1和NP_416333.4；大肠杆菌中表达的外源基因dpe来自根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）C58，NCBI序列号为WP_010974125.1，基因ptsG-F来源于大肠杆菌K-12菌株，其第34位碱基g突变为t，从而缬氨酸突变为苯丙氨酸，基因序列参考NCBI数据库，序列号为NP_415619.1。

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