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申请/专利权人：中国农业科学院生物技术研究所

摘要：本发明公开了紫花苜蓿CRISPRCas9多靶点编辑系统及其应用。本发明提供了一种用于紫花苜蓿CRISPRCas9基因组多靶点编辑的表达载体，包括三个sgRNA表达盒，三个sgRNA表达盒中启动子分别为MsU6‑d1promoterSEQIDNo.1的第1‑500位、MsU6g1promoterSEQIDNo.1的第789‑1317位和MsU6‑d3promoterSEQIDNo.1的第1606‑2095位，所述sgRNA1、所述sgRNA2和所述sgRNA3可针对紫花苜蓿的同一靶标基因或不同靶标基因。本发明根据紫花苜蓿同源四倍体的特点设计三个靶点，靶向同一基因或不同基因，本发明这种优化的基因组编辑系统大大提高了紫花苜蓿基因编辑效率，植株基因编辑效率可达42.9％，双靶点共编辑效率可达14.3％，三靶点共编辑效率可达7.1％。

主权项：1.一种用于紫花苜蓿CRISPRCas9基因组多靶点编辑的表达载体，其特征在于：所述表达载体包括sgRNA1表达盒、sgRNA2表达盒和sgRNA3表达盒；所述sgRNA1表达盒表达名称为sgRNA1的sgRNA；所述sgRNA1表达盒含有名称为MsU6-d1promoter的启动子和由所述MsU6-d1promoter驱动的所述sgRNA1的编码序列；所述MsU6-d1promoter的核苷酸序列如SEQIDNo.1的第1-500位所示或与其具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于紫花苜蓿具有启动子功能；所述sgRNA2表达盒表达名称为sgRNA2的sgRNA；所述sgRNA2表达盒含有名称为MsU6-g1promoter的启动子和由所述MsU6-g1promoter驱动的所述sgRNA2的编码序列；所述MsU6-g1promoter的核苷酸序列如SEQIDNo.1的第789-1317位所示或与其具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于紫花苜蓿具有启动子功能；所述sgRNA3表达盒表达名称为sgRNA3的sgRNA；所述sgRNA3表达盒含有名称为MsU6-d3promoter的启动子和由所述MsU6-d3promoter驱动的所述sgRNA3的编码序列；所述MsU6-d3promoter的核苷酸序列如SEQIDNo.1的第1606-2095位所示或与其具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于紫花苜蓿具有启动子功能；所述sgRNA1、所述sgRNA2和所述sgRNA3靶向紫花苜蓿基因组中的不同靶标基因或同一靶标基因。

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