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申请/专利权人：滨州医学院

摘要：本发明涉及RNA干扰技术领域，尤其是涉及一种基于人类miR‑30的pri‑miRNA改良序列及表达该序列的载体，pri‑miRNA改良序列的茎部引入了BamHI和Apal限制性内切酶识别位点。本发明对pri‑miRNA的序列即shRNAmir的框架进行改造，在不影响其生物学加工的前提下，对pri‑miRNA茎部的基因特异性shRNA序列两端进行改良，将其部分原始序列替换成了BamHI和Apal限制性内切酶识别位点，即BamHI和ApaI两个限制性内切酶的识别位点之间只有shRNA序列，从而保证克隆过程中只克隆很短的基因特异shRNA序列，后者即可以利用DNA寡核苷酸化学合成技术来合成，有效避免了pri‑miRNA基础序列被克隆进去的问题，确保了克隆的高效性和准确性。

主权项：1.一种载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：通过shERWOOD或SplashRNA在线工具设计shRNAmir序列，挑选评分最高的一条或几条shRNAmir；利用miR-ABOligotool将shRNAmir序列转换为两个基于miR-AB框架的序列；利用DNA寡核苷酸化学合成技术合成上述的两个基于miR-AB框架的序列；将合成好的上述两个DNA寡核苷酸通过退火形成一个双链DNA序列；将此双链DNA序列连接到BamHI和ApaI切割纯化后miR-AB的慢性病毒载体或逆转录病毒载体中；使用理化方法转化感受态细胞，使其吸收周围环境中的DNA分子，转化后的感受态细胞在培养基上培养，并筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆；所述miR-ABOligotool是基于MicrosoftExcel的工具，能够通过复制粘贴的方式，将源于shERWOOD或SplashRNA的序列转换成用于miR-AB克隆的两条DNA寡核苷酸序列；miR-AB的茎部引入了BamHI和Apal限制性内切酶识别位点，miR-AB的核苷酸序列如下： ；其中，加粗黑色字体代表引入的BamHI和ApaI酶切位点，方框表示基因特异性shRNA的Guide和Passenger序列；miR-AB的5’端包括5’-GGATCC-3’序列，且其能够被BamHI限制性内切酶识别并切割；miR-AB的3’端包括5’-GGGCCC-3’序列，且其能够被Apal限制性内切酶识别并切割。

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权利要求：

百度查询： 滨州医学院 一种pri-miRNA改良序列及表达该序列的载体