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申请/专利权人：广东省人民医院

摘要：本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9的墨西哥钝口螈半同源重组基因敲入方法。本发明基于CRISPR‑Cas9的半同源重组介导的墨西哥钝口螈基因敲入技术，不受限于基因位点的外显子个数和编码序列长度，在含有单个外显子的Sox2基因或多个外显子的FoxA2基因特定位点实现约5kb长片段memCherry和诱导型Cre重组酶的组合元件无瘢痕敲入，成功构建相应的转基因动物模型。本发明方法敲入效率高，可为特定细胞在神经再生过程中的细胞分化命运和动态变化研究提供强有力的工具。

主权项：1.一种基于CRISPR-Cas9的墨西哥钝口螈半同源重组基因敲入方法，其特征在于，包括如下步骤：1构建质粒①将Sox2基因片段作为半同源重组中的同源臂连接到质粒骨架中：对于只有一个外显子的Sox2基因，将Sox2基因位点外显子中的编码序列连接到经MluI和SphI酶切后的pGEMT-Pax7-ORFb-P2A-memCherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2-PA质粒骨架上，得到pGEMT-Sox2-P2A-memCherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2-PA质粒；②将FoxA2基因片段作为半同源重组中的同源臂连接到质粒骨架中：对于有多个外显子的FoxA2基因，将FoxA2基因位点的终止密码子上游500bp～1kbp的序列连接到经MluI和SphI酶切后的pGEMT-Pax7-ORFb-P2A-memCherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2-PA质粒骨架上，得到pGEMT-FoxA2-P2A-memCherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2-PA质粒；2gRNA设计在Sox2基因位点的终止密码子上或者靠近终止密码子200bp以内的3’-非编码区域上设计gRNA序列，命名为Sox2-gRNA；按同样的方式，在FoxA2基因位点上设计gRNA序列，命名为FoxA2-gRNA；3基因敲入将步骤①中得到的pGEMT-Sox2-P2A-memCherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2-PA质粒、步骤2中得到的Sox2-gRNA和Cas9蛋白混合后注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，经孵化发育成幼体，通过表型观察和或基因型鉴定，筛选得到F0代Sox2:memCherry-ERT2-Cre-ERT2转基因动物；或将步骤②中得到的pGEMT-FoxA2-P2A-memCherry-T2A-ERT2-Cre-ERT2-PA质粒，步骤2中得到的FoxA2-gRNA和Cas9蛋白混合后注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，经孵化发育成幼体，通过表型观察和或基因型鉴定，筛选得到F0代FoxA2:memCherry-ERT2-Cre-ERT2转基因动物。

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