申请/专利权人：上海睿璟生物科技有限公司

申请日：2024-02-20

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN117821596B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2024.04.23#实质审查的生效;2024.04.05#公开

摘要：本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及用于高灵敏度甲状腺结节良恶性辅助诊断的NGS检测方法。本申请提供用于甲状腺结节良恶性辅助诊断的基因群组，包括以下基因：AKT1、ALK、APC、ATM、BANP、BRAF、CDK12、CDKN2A、CHEK2、CTNNB1、DICER1、EGFR、EIF1AX、EP300、ERBB4、EZH1、FAM193A、FARSB、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GLIS3、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、KIT、KLK1、KMT2C、KMT2D、KRAS、LRP1B、MEN1、MET、MTOR、NCOR2、NF1、NF2、NOTCH1、NRAS、NTRK1、NTRK3、PIK3CA、PLEKHS1、POR、PPARG、PTEN、PTH、RB1、RBM10、RET、ROS1、SMAD4、SPOP、STK11、SUGCT、TP53、TRIM61、TSC2、TSHR、VHL、ZNF148和TERT。本发明通过提出特定的Panel组合范围，围绕其设计特定的扩增建库流程，结合指南，比传统方法检测甲状腺癌的灵敏度更高。

主权项：1.一种非疾病诊断目的的用于甲状腺结节良恶性辅助诊断的方法，包括以下步骤：1）从样本中提取DNA和RNA；所述样本选自甲状腺结节新鲜组织样本、穿刺活检细胞样本或石蜡包埋的固定组织样本；DNA来自基因群组中的单基因；RNA来自基因群组中的融合基因；所述基因群组的单基因为：AKT1、ALK、APC、ATM、BANP、BRAF、CDK12、CDKN2A、CHEK2、CTNNB1、DICER1、EGFR、EIF1AX、EP300、ERBB4、EZH1、FAM193A、FARSB、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、GLIS3、GNAQ、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、KIT、KLK1、KMT2C、KMT2D、KRAS、LRP1B、MEN1、MET、MTOR、NCOR2、NF1、NF2、NOTCH1、NRAS、NTRK1、NTRK3、PIK3CA、PLEKHS1、POR、PPARG、PTEN、PTH、RB1、RBM10、RET、ROS1、SMAD4、SPOP、STK11、SUGCT、TP53、TRIM61、TSC2、TSHR、VHL、ZNF148和TERT；所述基因群组的融合基因为第一基因断点的上游区段和第二基因断点的下游区段融合形成；所述第一基因及其断点选自以下： 基因 断点处外显子号 基因 断点处外显子号 基因 断点处外显子号 AGGF1 5 GFPT1 19 RBPMS 5 AGK 2 GOLGA5 7 RELCH 10 AKAP13 35 GOPC 4 RMDN3 7 AKAP9 21 GOPC 8 RNF213 2 AKAP9 7 HIP1 21 SDC4 2 AKAP9 8 HIP1 28 SDC4 4 AP3B1 22 HIP1 30 SEC31A 20 ATIC 7 HOOK3 11 SHTN1 11 BCL2L11 3 IRF2BP2 1 SLC34A2 13 CARS 17 KIAA1217 11 SLC34A2 4 CCDC30 11 KIAA1549 12 SND1 10 CCDC6 1 KIAA1549 14 SND1 14 CCDC6 2 KIAA1549 15 SND1 9 CCDC6 8 KIAA1549 17 SPECC1L 10 CCNY 1 KIAA1549 18 SQSTM1 5 CD74 6 KIAA1598 11 SSBP2 12 CLTC 30 KIF5B 15 STRN 3 CLTC 31 KIF5B 16 SYN2 5 CREB3L2 2 KIF5B 17 TANK 4 DCTN1 16 KIF5B 22 TBL1XR1 9 DCTN1 26 KIF5B 23 TFG 4 EGFR 24 KIF5B 24 TFG 5 EML4 13 KLHL7 5 TFG 6 EML4 14 KTN1 29 THADA 28 EML4 15 LMNA 2 THADA 29 EML4 17 LRIG3 16 THADA 30 EML4 18 MACF1 60 THADA 31 EML4 2 MKRN1 4 THADA 35 EML4 20 MSN 11 THADA 36 EML4 6 NACC2 4 TPM3 7 ERC1 11 NCOA4 7 TPM3 8 ERC1 12 NCOA4 8 TPR 15 ETV6 4 NPM1 4 TPR 21 ETV6 5 PAX8 10 TPR 6 EZR 11 PAX8 2 TRIM24 10 FAM114A2 9 PAX8 7 TRIM24 3 FGFR1 1 PAX8 8 TRIM24 5 FGFR1 14 PAX8 9 TRIM24 8 FGFR1 17 PCM1 29 TRIM24 9 FGFR1 2 POR 3 TRIM27 3 FGFR2 17 PPFIBP1 9 TRIM33 16 FGFR3 17 PRKAR1A 7 UACA 17 FGFR3 18 QKI 6 VCL 16 FKBP15 9 RANBP2 18 ZC3HAV1 7 FN1 23 RBMS3 11 所述第二基因及其断点选自以下： 基因 断点处外显子号 基因 断点处外显子号 AFF3 7 NTRK3 14 ALK 19 NTRK3 15 ALK 20 OFD1 3 BAIAP2L1 2 PLAG1 2 BICC1 10 PPARG 1 BRAF 10 PPARG 2 BRAF 11 RAD51 4 BRAF 8 RAF1 9 BRAF 9 RET 11 CASP7 7 RET 12 CCAR2 4 ROS1 32 CCDC6 2 ROS1 34 GLIS1 2 ROS1 35 GLIS3 3 ROS1 36 IGF2BP3 2 SEPTIN14 10 IGF2BP3 3 SEPTIN14 8 LOC389473 1 SLC26A11 8 LTK 10 TACC1 7 MET 15 TACC3 10 NTRK1 10 TACC3 11 NTRK1 12 TACC3 4 NTRK1 9 TACC3 8 NTRK2 13 TACC3 9 NTRK2 16 ZNF703 2 2）对步骤1）的DNA进行分管叠瓦式多重扩增构建测序文库；分管叠瓦式多重扩增的覆盖范围为DNA基因的全部外显子区域、及向外拓展的至少20个碱基的区域；3）对步骤1）的RNA进行逆转录后多重扩增构建测序文库；逆转录扩增的范围是基因群组中的融合基因的表达转录本；4）将步骤2）和步骤3）的测序文库进行生物信息分析，根据基因群组的信息基于指南判断甲状腺结节良恶性；所述指南选自美国AMPASCOCAP组织制定的体细胞变异解读指南；进行生物信息分析的方式包括：对样本的DNA对应的测序文库以及RNA对应的测序文库进行数据质量控制；将样本中经过数据质量控制的DNA对应的测序文库以及RNA对应的测序文库对应与DNA参考基因组以及DNA参考基因组进行比对，以获得DNA基因比对结果以及RNA基因比对结果；基于样本的DNA基因比对结果以及RNA基因比对结果进行变异检测以及融合检测，并对变异位点进行过滤；基于注释数据库对各样本过滤后的变异位点作为检出位点进行注释，并标注其分子生物学和人群信息特征；步骤2）或步骤3）中，扩增所用的引物采用NGS-PrimerPlex软件设计获得；扩增所用的引物的配比通过采集引物特征数据，基于向量回归模型优化确定；测序文库构建时，包括将目的片段连接index进行测序。

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