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申请/专利权人：深圳市先康达生命科学有限公司
申请日：2024-03-29
公开（公告）日：2024-06-28
公开（公告）号：CN118256532A
主分类号：C12N15/66
分类号：C12N15/66
优先权：
专利状态码：在审-公开
法律状态：2024.06.28#公开
摘要：本发明公开了一种在环状载体上引入目的基因的构建方法，包括步骤：获取目的基因及含双酶切和单酶切位点的环状载体；在目的基因上构建双酶切位点；将环状载体、目的基因及双切酶混合进行双酶切反应，获得双酶切的线性载体和目的基因片段；将双酶切的线性载体和目的基因片段连接反应后得到含目的基因的环状载体；将未参与双酶切反应的环状载体进行单酶切，得到包括无需胶回收的线性载体的单酶切产物混合体系。该构建方法，直接将未进行双酶切反应的环状载体进行单酶切后形成线性载体，使其失去活性，不影响已经引入目的基因的环状载体的后续反应，省去了回收纯化处理，避免了胶回收过程中DNA的损失。
主权项：1.一种在环状载体上引入目的基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：环状载体与目的基因的准备：分别获取环状载体及目的基因，并在所述环状载体上筛选出双酶切位点和单酶切位点；目的基因的PCR扩增反应：以所述目的基因为模板，在含有目的基因的上游引物与下游引物、DNA聚合酶的反应体系中进行PCR扩增反应，在所述目的基因两端构建与所述环状载体上的双酶切位点相同的双酶切位点，获得含双酶切位点的目的基因片段；双酶切反应：将所述环状载体、目的基因片段及双切酶混合，构建双切酶反应，分别对所述环状载体以及目的基因片段上各自的双酶切位点进行双酶切，获得双酶切产物混合体系，该双酶切产物混合体系中包括两端分别含双酶切位点粘末端的目的基因片段和线性载体，以及未进行双酶切反应的环状载体；连接反应：往所述双酶切产物混合物体系中加入连接酶，进行连接反应，将两端分别含有双酶切位点粘末端的目的基因片段连接到两端分别含有双酶切位点粘末端的线性载体上，获得含目的基因的环状载体的连接产物混合体系；单酶切反应：往连接产物混合体系中加入单切酶，对连接产物混合体系中未进行双酶切反应的环状载体的单酶切位点进行裁切，获得包括无需胶回收的线性载体及含目的基因的环状载体的单酶切产物混合体系。
全文数据：
权利要求：
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