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申请/专利权人：石河子大学

摘要：本发明公开了一种基于DNA甲基化的猪早孕诊断的方法，包括以下步骤：采集血液样本；提取DNA；筛选差异基因并运用BSP方法验证；运用MSP方法验证；建立pcr检测方法；RRBS；血液DNA甲基化研究；差异基因功能富集分析；基于基因组酶切富集片段区域甲基化图谱的PCA分析；DMC的鉴定与富集分析；DMRs的鉴定与富集分析；甲基化差异基因验证；得出结论。本发明运用RBSS技术系统分析妊娠早期猪血液DNA甲基化的变化情况，筛选出可指示母猪早期妊娠诊断的靶标基因与信号通路，并揭示母猪在怀孕和未怀孕时血液循环中的甲基化状态，得出母猪妊娠早期全基因组DNA甲基化的变化水平，从而更加经济简单且准确的诊断母猪早期妊娠。

主权项：1.一种基于DNA甲基化的猪早孕诊断的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1：采集血液样本：采集自新疆某猪场的母猪血液，用前腔静脉采血采集20头未怀孕母猪的血液pre0猪血样混样和20头怀孕28天的母猪的血液pre28猪血样混样于肝素化管中，并在运输过程中被冰冻保存；S2：血液离心并提取DNA：将血液在1600xg下离心15min后，将血浆保存在-20℃直到进行分析，利用血液DNA试剂盒提取血液样本DNA并送至易基因公司进行测序，采用的测序方法为RRBS；S3：筛选差异基因并运用BSP方法验证：根据测序结果筛选启动子区域甲基化上调、下调各20个基因并利用MethPrime网站设计BSP引物，根据设计出来的引物序列，合成引物，使用EpiArtDNAMethylationBisulfiteKit试剂盒对提取的猪血液DNA进行甲基化修饰；DNA甲基化修饰后的样品进行PCR扩增，扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶纯化试剂盒回收PCR扩增的DNA产物，并将其克隆到pMD19-T载体Takara中，室温连接5min后转化E.coliDH5α感受态细胞，涂菌并挑选单克隆小量培养；随机挑选15-20个阳性克隆利用pMD19-T载体通用测序引物测序，使用在线软件分析测序数据中CpG-C-T转化率；靶序列的甲基化状态显示为甲基化的CpGs在CpGs总数中的百分比，利用Fisher’sexactT检验进行统计学差异分析，从而评价怀孕组与未怀孕组之间的结果情况；S4：运用MSP方法验证：将BSP方法筛选出来的基因进一步设计MSP引物，利用MethPrime网站设计并合成MSP引物，同样使用EpiArtDNAMethylationBisulfiteKit试剂盒对提取的猪血液DNA进行甲基化修饰；DNA甲基化修饰后的样品进行PCR扩增，扩增后的样品进行琼脂糖凝胶电泳，分析各基因的甲基化程度，从而评价怀孕组与未怀孕组之间的情况；S5：ReducedRepresentationBisulfiteSequencingRRBS：简化基因组甲基化测序利用重亚硫酸氢盐能够将未甲基化的胞嘧啶C转化为胸腺嘧啶T的特性，将基因组用重亚硫酸氢盐处理后测序，即可根据单个C位点上未转化为C未转化为T的reads数目与所有覆盖的reads数目的比例，计算得到甲基化率；构建文库需要较高质量的基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品完整性，对样品进行限制性酶切富集CpG片段，接着进行末端加A修复；电泳回收选择富含CpG的250-500bp片段，向回收的基因组DNA中加入lamdaDNA，随后通过Bisulfite处理将未甲基化碱基C转化成U，然后通过PCR扩增富集文库及纯化PCR产物获得最终文库；对于构建完成的文库先使用Qubit2.0Fluorometer进行初步定量，接着利用qRT-PCR对文库的有效浓度进行准确定量，文库有效浓度需高于2nM，以保证文库质量；对质检合格的文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求对质检合格的不同文库进行Illumina测序，测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据reads，然后利用软件cutadapt对原始数据进行过滤，接着利用BSMAP软件将重亚硫酸氢盐转化的reads与参考基因组进行比对；S5：妊娠母猪血液DNA甲基化的研究：对各样本甲基化水平分布比较发现，在pre0和pre28样本中，CG的甲基化水平高，而CHH和CHG甲基化水平低；甲基化水平在不同的基因元件中会呈现不同的趋势，且这个趋势与大部分哺乳动物的趋势整体一致；样品pre28的整体甲基化水平稍高，upshelf、downshelf他们的平均甲基化水平最高，而在upshore和downshore中间有一部分甲基化水平呈现下降趋势，一直下降到CGI；CGI的平均甲基化水平最低，且CGI及其附近的甲基化水平较低，且pre28与pre0组的甲基化水平存在显著差异；从整体来看，pre28的甲基化水平稍高，其中Genebody的甲基化水平最高，down2k其次，promoter区域的甲基化水平最低，且越靠近genebody区域，甲基化水平越低，但是当快到达genebody区域时，甲基化水平开始呈现上升趋势，且在靠近down2k区域时达到最高，而在down2k中，甲基化水平又开始呈现下降趋势；妊娠母猪在upshelf、downshelf、upshore、downshore、promoter、genebody和down2k区域的甲基化水平明显高于非妊娠母猪；S6：差异基因的功能富集分析：分别使用基因本体GeneOntology，GO和京都基因与基因组百科全书KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG对甲基化差异基因功能进行注释；富集分析采用Fisher检验，结合BH矫正；当P值小于0.05时，认为GO或者是KEGG功能显著富集，反之不显著富集；S7：基于基因组酶切富集片段区域甲基化图谱的PCA分析：基于单个胞嘧啶，进行主成分分析PCA，结果显示怀孕28天的母猪和未怀孕的母猪的DNA甲基化之间存在显著差异，说明这2个组的样本之间的相似性很低，区分度很高；接下来，对怀孕28天的母猪和未怀孕的母猪血液CpG甲基化进行全面的全基因组表征分析；S8：差异甲基化位点DMC的鉴定与富集分析：S8.1：DMC的鉴定：利用软件MethylKit对组间DMC进行了鉴定，在pre0和pre28样品之间，一共鉴定出了64908个差异甲基化位点，其中有39637个位点属于甲基化上调，有25271个位点属于甲基化下调；差异甲基化位点DMC在染色体上的分布有偏好性，在chr6这条染色体上hyper和hypo的甲基化水平最高，并且hyperDMC和hypoDMC分布在不同的染色体上，这表明怀孕28天母猪的血液基因在全基因组范围内具有广泛而显著的甲基化变化；且有441个hyper甲基化位于promoter区域，有210个hypo甲基化位于promoter区域；根据fisherT检验发现Exon和promoter区域甲基化上调位点与下调位点差异显著P0.5；S8.2：GO分析：对甲基化差异基因进行GO分析，结果显示甲基化上调基因主要富集于MF，且Nuclear-receptor-avtivity核受体活动富集到的基因数目最多，可行性最高；此外启动子区域甲基化上调基因主要富集于BP，且凋亡过程中半胱氨酸型内肽酶活性的负调控富集到的基因数目最多，可行性最高；甲基化下调基因主要富集于BP中血红素结合这一条目，且富集到的基因数量多，可行性最高；启动子区域甲基化下调基因主要富集于分子功能中的激素活性，且富集基因有7个；S8.3：KEGG分析：对差异甲基化基因进一步进行KEGG分析，结果显示所有甲基化上调的基因主要富集于KEGG数据库中的疾病，富集程度较高的是心血管疾病：流体剪切应力与动脉粥样硬化，且富集的基因数量多，可行性较高；同时启动子区域甲基化下调基因同样富集于疾病，且只富集于内分泌和代谢疾病：库欣综合征，富集于该条目的基因有3个；S9：差异甲基化区域DMRs的鉴定与富集分析：S9.1：DMRs的鉴定：在pre0和pre28样品之间，一共鉴定出了12119个差异甲基化区域，其中高甲基化n＝7786多于低甲基化n＝4333，在12119个DMRs中，有117个DMRs位于promoter区域，995个位于genebody区域，有89个既位于promoter区域，又位于genebody区域；DMRs在染色体上分布有偏好性，实验发现在chr6这条染色体上hyper和hypo的甲基化水平最高，并且hyperDMRs和hypoDMRs分布在不同的染色体上，这说明怀孕28天母猪的血液基因在全基因组范围内具有广泛而显著的甲基化变化；同时发现有有107个hyper甲基化位于promoter区域，70个hypo甲基化位于promoter区域；根据fisherT检验发现Exon和promoter区域甲基化上调区域与下调区域差异显著P0.5；S9.2：GO分析：对甲基化差异基因进行GO分析，发现所有甲基化上调的基因主要富集于MF，且只富集于MF中的1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶活性，富集于该条目的基因有5个；此外启动子区域甲基化上调基因主要富集于转化生长因子β受体信号通路的调控这一生物过程，虽然富集于该条目的基因数量少，但是可行性较高；所有甲基化下调的基因主要富集于BP，且富集于肌管细胞发育和细胞钙离子稳态等生物过程，可行性高；启动子区域甲基化下调基因主要富集于CC，富集程度较高的是线粒体外膜，且富集于该条目的基因数量多，可行性较高；S9.3：KEGG分析：对所有甲基化上调基因进行KEGG分析，结果显示甲基化上调基因主要富集于KEGG数据库中的疾病，富集程度较高的是心血管疾病：流体剪切应力与动脉粥样硬化，且富集的基因数量多，可行性高；S10：甲基化差异基因验证：筛选启动子区域甲基化上调和下调比较明显的基因进行验证，将筛选的基因先进行可视化分析并以其启动子区域有差异的peak来设计引物；运用BSP亚硫酸氢盐测序方法进行验证，最终筛选得到了五个基因，其中甲基化上调基因为：VBP1、UPRT，且在统计学上有意义，P0.01；甲基化下调基因为：RPL10、RAB33A且在统计学上有意义，P0.01和CD93；S11：得出结论：明确了母猪妊娠早期全基因组甲基化的变化水平：Pre28相较于Pre0甲基化明显上调，且系统的鉴定出了39637个甲基化上调DMC,7786个甲基化上调的DMRs；且筛选并验证了启动子区域甲基化差异明显的基因：VBP1、UPRT、RPL10、RAB33A且在统计学上有意义，P0.01和CD93，其中VBP1、RPL10和CD93与胚胎细胞的生长发育相关。

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