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申请/专利权人:武汉中帜生物科技股份有限公司
摘要:本发明公开了一种基于RNA恒温扩增‑金探针层析技术检测淋病奈瑟菌核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸,然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下,经过逆转录和转录过程,实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获,形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物,该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带,实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程,不需要特殊仪器,基于RNA恒温扩增,在实际检测中不易污染,具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势,使淋病奈瑟菌核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
主权项:1.一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术检测淋病奈瑟菌核酸的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:1扩增反应液:含40mMpH8.0的Tris-HCl,12mMMgCl2,70mMKCl,15%DMSO,5mMDTT,每种dNTP各1mM,每种NTP各2mM,扩增引物各0.2μM,扩增中需要两对引物:淋病奈瑟菌扩增引物、内质控18S引物;1淋病奈瑟菌扩增引物:NG-R引物5’-3’:TAATCTGACTCACTAACGGGAGACTCAGACTGCGGACTGATCG;NG-F引物5’-3’:TTGGTCGACGTACAAACTAGC;2内参基因的扩增引物:内参-R引物5’-3’:TAATACGACTCACTATAGGGAGACACAGTTATCCAAGTAGGAG;内参-F引物5’-3’:TCCTGCCAGTAGCATATGCT;2扩增酶:包含三种,逆转录酶、T7RNA聚合酶和RnaseH;3核酸提取试剂:细胞裂解液;4检测液:包含金探针,为胶体金颗粒标记的核酸探针、每个指标的特异探针、C线显色探针,每个指标特异探针有两种,分别为CES系列和LES系列,其中CES系列和LES系列又可以设计多条,具体如下:1淋病奈瑟菌特异探针5’-3’:NG-CES1:TACGTCTTGAGAGGGAAttttGCTCGACTTGCCACCGAATA;NG-LES1:TCGGGCCAAGTGCAATCCttttGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT;NG-LES2:ATCAATGCCTACGATATTttttGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT;2内参特异探针5’-3’内参CES1:TTGGCTGAAGAATCCAACttttATCTGTATAGTGTCTGT;内参CES2:TTGACATGGAGCCTGCGGttttATCTGTATAGTGTCTGT;内参LES1:CTTAATTTGACTCAACACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC;内参LES2:CCTAGAAGCACGTCGTTCGttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG;内参LES3:AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC;3C线显色探针5’-3’TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC;4金探针金探针5’端被巯基化修饰,所述序列为:5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCTCGAGCACTGCG-3’5试纸条:所用试纸条被固定于PVC底板上,从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸;NC膜上有质控线C线和两条检测线T线,从样品垫到吸水纸方向分别为NG-T、内参-T和C线;NG-T处包被NG包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针,具体序列5’-3’为:NG包被探针:ACACCAGCTATAGATAttttACACCAGCTATAGATA;内参包被探针:CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT;C线包被探针:GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA。
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