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申请/专利权人：南京农业大学

摘要：本发明公开了一种在全基因组水平鉴定植物R‑loop位点的方法，包括如下主要步骤：利用核糖核酸酶H特异性地识别并消化R‑loop结构中DNA‑RNA杂合链，同时在DNA聚合酶I作用下，以DNA‑RNA杂合链中的DNA链为模板按照碱基配对方式及时修补被RNaseH切割的RNA位点，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基，最后，新合成的互补DNA链含有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基；利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段，结合单链DNA文库试剂盒构建单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定R‑loop位点。本发明的整个方法流程简单，所需DNA用量范围广100ng‑8μg，可视化效果强，理论上该方法适应于多种植物。

主权项：1.一种在全基因组水平鉴定植物R-loop位点的方法，其特征在于，利用核糖核酸酶H特异性地识别并消化R-loop结构中DNA-RNA杂合链，同时在DNA聚合酶I作用下，以DNA-RNA杂合链中的DNA链为模板按照碱基配对方式及时修补被RNaseH切割的RNA位点，在修补过程中插入具有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基，最后，新合成的互补DNA链含有生物素标记的dATP和dCTP核苷酸碱基；利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段，结合单链DNA文库试剂盒构建单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，结合生物信息学分析，从而在全基因水平鉴定R-loop位点；优选的，该方法主要包括如下步骤：1提取并纯化植物材料的细胞核；2提取基因组DNA；3将DNA片段化至100-500bp，并利用琼脂糖凝胶电泳检测片段化效果；4酶切并原位标记R-loop位点；5回收反应后含有biotin标记的新合成的DNA；6利用高温将含有biotin标记的双链DNA变性成为单链DNA；7利用链霉抗生物素蛋白的磁珠捕获并富集含有生物素标记的DNA片段；8利用单链DNA文库试剂盒构建含有biotin标记的单链DNA测序文库，通过测序平台配对测序，获得测序原始数据，经生物信息学分析，在全基因组水平鉴定R-loop位点。

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