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申请/专利权人：湖北省药品监督检验研究院

摘要：本发明公开了一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针，第一组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，用于检测三线镰刀菌；第二组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列，用于检测黄曲霉菌；第三组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：5所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：6所示的核苷酸序列，用于检测赭曲霉菌。本发明能在很短的时间内同时对中药材三种优势产毒真菌进行检测，该方法具有特异性好，检测灵敏度高等优点。

主权项：1.一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针，其特征在于：所述探针共有三组，每组探针分别由左侧探针LPO和右侧探针RPO组成，其中，第一组探针的左侧探针LPO的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，右侧探针RPO的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，用于检测三线镰刀菌；第二组探针的左侧探针LPO的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，右侧探针RPO的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，用于检测黄曲霉菌；第三组探针的左侧探针LPO的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，右侧探针RPO的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示，用于检测赭曲霉菌。

全文数据：一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针及其应用技术领域本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种同时检测中药材黄曲霉、三线镰刀菌、赭曲霉三种毒源真菌污染的MLPA探针，本发明还涉及一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA方法和试剂盒。背景技术中药因其具有独特的疗效与作用，在保健、防治疾病、康复等方面发挥出了独特的优势，现已成为国际医药市场不可缺少的部分，受到了全世界消费者的关注。但是中药材及饮片生产模式粗放，全产业链问题繁多，在加工储藏环节尤为突出，导致产毒真菌滋生，部分中药材真菌污染率甚至高达95％。真菌分泌的酶能使药材化学成分降解导致药效降低，同时更重要的是它们产生的真菌毒素给服用者带来中毒危险，如曲霉属真菌产生的黄曲霉毒素是迄今为止最毒化合物之一，其毒性是奶油黄的900倍，砒霜的68倍，被划定为一类致癌物。通过对大量中药材抽查发现除了曲霉属真菌污染高检出外，部分药材镰刀菌属真菌污染率甚至高达97.6％。因此，中药产生的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2毒素主要由三线镰刀菌产生、呕吐毒素等已是影响中药质量与使用安全的重要问题，快速检测其毒源真菌是对中药材真菌毒素污染进行及时监控和防治的关键。然而由于毒素合成能力差异，并非同种所有菌株都能产生毒素，如曲霉属大部分真菌并不产毒，甚至常被用于传统食品加工。黄曲霉菌作为黄曲霉毒素主产菌，也仅10％的菌株可产毒素，且从形态上目前仍无法区分产毒株与非产毒株，给中药材毒源真菌污染及时防控造成很大技术瓶颈。随着真菌毒素合成基因的发现，从基因水平解释了产毒差异的根源，可利用分子生物学方法对合成途径关键基因进行检测并有效辨别产毒真菌。多重连接依赖式探针扩增技术MultiplexLigation-dependentProbeAmplification,简称MLPA是一种新型的高通量体外核酸检测技术，该技术包括杂交-连接-扩增三个步骤，其中杂交和连接步骤保证了检测的特异性，扩增步骤使用通用引物进行PCR扩增，保证不同目标产物在扩增时效率一致，有效解决了多重PCR中扩增效率不一致和容易出现交叉反应的缺点，是一种方便、准确、廉价的多重核酸检测技术，在现场即时检测领域得到广泛关注。目前还没有采用MLPA方法对中药材多种毒源真菌进行检测的报导。发明内容本发明针对中药材三种优势产毒真菌黄曲霉菌、赭曲霉菌及三线镰刀菌，采用MLPA检测技术对其真菌毒素合成途径关键基因进行检测，从而建立一种同时检测中药材中三种毒源真菌污染的MLPA探针及其即时检测方法。本发明的第一个目的是提供一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针，所述探针共有三组，每组探针分别由左侧探针LPO和右侧探针RPO组成，其中，第一组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，用于检测三线镰刀菌；第二组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列，用于检测黄曲霉菌；第三组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：5所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：6所示的核苷酸序列，用于检测赭曲霉菌。本发明的第二个目的是提供一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA方法，该方法包括以下步骤：1提取待测中药材的真菌基因组DNA；2将权利要求1所述的MLPA探针与真菌基因组DNA进行杂交；3利用通用引物对步骤2的杂交产物进行PCR扩增；4对PCR扩增产物进行检测。优选地，所述通用引物的上游引物和下游引物分别具有如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的核苷酸序列。优选地，步骤4中，使用毛细管电泳对PCR扩增产物进行检测，若108bp处有扩增峰，则中药材存在黄曲霉菌污染；若94bp处有扩增峰，则中药材存在三线镰刀菌污染；若100bp处有扩增峰，则中药材存在赭曲霉菌污染。本发明的第三个目的是提供一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA试剂盒，该试剂盒含有杂交混合液，连接混合液和通用引物，所述杂交混合液中含有以上所述的MLPA探针。本发明能在很短的时间内同时对中药材三种优势产毒真菌进行检测，该方法具有特异性好，不会受到干扰，检测灵敏度高等优点，在中药质量控制和检疫中具有很好的应用前景。附图说明图1是分别采用ordA单一探针和混合探针对黄曲霉菌基因组DNA进行杂交后的MLPA实验图谱。A是单一探针，B是混合探针。图2是分别采用tri5单一探针和混合探针对三线镰刀菌基因组DNA进行杂交后的MLPA实验图谱。A是混合探针，B是单一探针。图3是分别采用aoks1单一探针和混合探针对赭曲霉基因组DNA进行杂交后的MLPA实验图谱。A是单一探针，B是混合探针。图4是采用混合探针对中药材真菌基因组DNA进行杂交后的MLPA实验图谱。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1三种真菌的基因组DNA提取及目的片段扩增1.产毒真菌基因组DNA的提取对三种产毒真菌分别进行基因组DNA提取，具体方法可采用SDS法、真菌基因组DNA提取试剂盒和磁珠法真菌DNA提取试剂盒。下面以真菌基因组DNA提取试剂盒为例，具体步骤如下：1取50-100mg菌丝于2mL离心管中，加200μL溶液A，适当研磨分散菌丝，再向离心管中加入20μLRNaseA，并加入100mg玻璃珠，于高速震荡器上震荡30min。2震荡完后，再向离心管中加入20μL的蛋白酶K10mgmL，混匀，于55℃水浴消化30min，期间可多次颠倒离心管混匀。12,000rpm离心2min。转移上清液到另一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心3向装有上清液的离心管中加入200μL的溶液B，充分混匀。4再加入200μL无水乙醇，充分混匀。5将离心管置于微型离心机中12,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。6向吸附柱中加入600μL漂洗液，12,000rpm离心1min，去废液，将吸附柱放入收集管。7重复上述操作。812,000rpm继续离心2min后，将吸附柱放置于室温中数分钟，待吸附柱中残余的液体挥干。9取干净的离心管将吸附柱放入其中，将洗脱液于65℃水浴预热，吸取50μL的洗脱液悬空滴加到吸附膜中央，室温放置5min，12,000rpm离心1min。10洗脱液再加入吸附柱中，于室温放置2min，12,000rpm离心2min，洗脱液即为基因组DNA。于-20℃冰箱保存备用。2.PCR反应根据基因生物合成途径特异性特征，选取黄曲霉毒素生物合成途径的关键基因ordAAF054820.1、赭曲霉毒素生物合成途径的关键基因aoksAY583209.1及T-2毒素生物合成途径的关键基因tri5AF449790的特异保守区域，利用Primer3http:primer3.ut.ee软件设计PCR扩增引物。黄曲霉引物：OrdA-L：AGCCTATCATTGGCAACCTGOrdA-R：AAGAGCACCTTTGGGCAGTA赭曲霉引物：aoks-L：GACAAACCTGATCTTGGCCCaoks-R：CATCGTGATACCCATGCTGC三线镰刀菌引物：tri5-L：TTGGCTCAGTCTTTAGGCCTtri5-R：GTGACATAGCCGTGCATGAA反应体系如下：ComponentsVolume1中获得的真菌基因组DNA2μl2中对应的LeftPrimer10μM1μl2中对应的RightPrimer10μM1μl10×BufferIIbuffer含Mg2+5μlTransTaqHiFiDNAPolymerase0.5μl2.5mMdNTPs4μlddH2O36.5μl反应程序：94℃3min；94℃1min，62℃2min，72℃2min，37个循环；72℃8min，PCR扩增获得目的基因片段。黄曲霉菌扩增目的片段核酸序列为SEQIDNO:9所示的序列：ATTCGACATACTGAACATGGGTAATATAACTATAGGGAAGCCAACGCCTTCATGATGGATGTGGCCTATGGGTACACGATTGCGCCGCATGGAAAAGATGAGTTGTATGATCTGACCCAACAGTCGGTTCGGCAGTTTTCGCACATCTTCTCGCCAGGAGAGTGGAGTGTCAATTTCTTCCCGATATGTGAGAAGACCTACATAAAAGGTTCCGGCAAATGCTGATTCTGGGGCAGTGCGATACGTACCATCCTGGTTCCCCGGAGCCTSEQIDNO:9赭曲霉菌扩增目的片段核酸序列为SEQIDNO:10所示的序列：TGAGTATGCTGTCGCCGCACGGCCGCAGTCGTATGTGGGATGCCGGCGCAGATGGCTACGCGCGTGGCGAAGGTGTCGCAGCCGTAGCCCTCAAGCGACTCAGCGACGCTATCGCCGACGGCGACGCTATCGAATGCATTATSEQIDNO:10三线镰刀菌扩增目的片段核酸序列为SEQIDNO:11所示的序列：TTCTACAAGGAATTTGACGATGAGCTGATGAGATCAGCCTCCACGAAGCTTTGGAGAAACTCACCCTTGACACTCAAAGACCCTCAGGTGATGGASEQIDNO:11利用BLAST同源比对程序将获得的扩增产物序列针对NCBI核酸非冗余数据库进行同源比对，SEQIDNO:9比对且仅比对到ordA基因，SEQIDNO:10比对且仅比对到aoks基因，SEQIDNO:11比对且仅比对到tri5基因，则表明扩增产物与目标产物一致。实施例2目的扩增峰定位1探针设计：利用实施例1扩增的基因序列，使用Primer3http:primer3.ut.ee设计MLPA探针对，使用UseUNAfoldhttp:unafold.rna.albany.edu？q＝mfold评价探针质量，最终得到以下三组探针并人工合成。探针组1用于检测三线镰刀菌：tri5_LPO：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATGATGAGATCAGCCTCCACGAAGCTTTSEQIDNO:1tri5_RPO：GGAGAAACTCACCCTTGACACTCTCTAGATTGGATCTTGCTGGCACSEQIDNO:2探针组2用于检测黄曲霉菌：ordA_LPO：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATTGTATGATCTGACCCAACAGTCGGTTCGGCAGTTSEQIDNO:3ordA_RPO：TTCGCACATCTTCTCGCCAGGAGAGTGGAGTGTTCTAGATTGGATCTTGCTGGCACSEQIDNO:4探针组3用于检测赭曲霉菌：aoks1_LPO：GGGTTCCCTAAGGGTTGGATCGAATGCATTATTCCTGCTACCCATATCAASEQIDNO:5aoks1_RPO：CCAGGATGGTCGCAGCATGGGTATCACGATCTAGATTGGATCTTGCTGGCACSEQIDNO:62探针制备：将探针制备成10μM的储存溶液，使用时稀释为1μM的工作溶液。分别取三组探针中的LPO探针和RPO探针0.8μL，加TE至600μL，制备成三种单一探针；另外同时取探针组1、探针组2及探针组3的LPO探针和RPO探针各0.8μL，加TE至600μL制备成含有三种探针的混合探针。3DNA变性：分别取黄曲霉菌、赭曲霉菌、三线镰刀菌的基因组DNA各5μL50～100ngμL于0.2mL离心管中；取TE缓冲液5ngμL作阴性对照。将离心管置于PCR扩增仪中98℃变性5min，待PCR扩增仪温度降至25℃后备用。4杂交反应：分别向上述变性后的黄曲霉菌、赭曲霉菌、三线镰刀菌的基因组DNA中加入预先混合好的3μL杂交混合液1.5μL与真菌对应的单一探针或混合探针+1.5μLMLPA缓冲液，充分混匀，杂交程序为95℃，1min，60℃左右适宜温度下孵育16h，待仪器温度降至54℃。5连接反应：加入预先混合好的32μL连接混合液体系3μLLigaseBufferA+3μLLigaseBufferB+1μLLigase-65+25μLddH2O，54℃15min，98℃5min灭活，冷却至20℃。6PCR扩增反应：PCR反应体系包括7.5μLddH2O+2μLSALSAPCR-PrimerMix+0.5μLSALSApolymerase，充分混匀，加入离心管中，设置PCR程序为95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃20min，停留在15℃。其中MLPA通用扩增引物序列如下：RP:5′-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3′SEQIDNO:7FP：5′-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3′SEQIDNO:87结果检测：反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳观察特异性条带，将具有特异性条带的样品进行毛细管电泳检测，使用GeneMarkerV2.4.0软件分析MLPA实验图谱，提取荧光PCR片段的大小、峰高和峰面积信息。图1是分别采用ordA单一探针和混合探针对黄曲霉菌基因组DNA进行杂交后的MLPA实验图谱，从图中可以看出，在约108bp处存在明显目的扩增峰。图2是分别采用tri5单一探针和混合探针对三线镰刀菌基因组DNA进行杂交后的MLPA实验图谱，从图中可以看出，在约94bp处存在明显目的扩增峰。图3是分别采用aoks1单一探针和混合探针对赭曲霉基因组DNA进行杂交后的MLPA实验图谱，从图中可以看出，在约100bp处存在明显目的扩增峰。实施例3MLPA同时检测中药材中三种毒源真菌污染1中药材中真菌基因组DNA的提取：称取药材粉末过二号筛50～100mg于0.2mL离心管中，加入1mL的8.5％NaCl溶液于上述离心管中，并加入两颗直径5mm灭菌钢珠，放置于高通量组织研磨机上，震摇20min，使真菌得到充分释放，12,000rpm离心5min，取上清液作为预处理样品液。取上述预处理样品液1mL于离心管中，据实施例1中所述方法，使用真菌基因组DNA提取试剂盒对中药材中污染的真菌DNA进行提取，提取液储存于-20℃保存备用。2DNA变性：取步骤1中得到的样品基因组DNA5μL50～100ngμL于0.2mL离心管中；取TE缓冲液5ngμL作阴性对照。将离心管置于PCR扩增仪中98℃变性5min，待PCR扩增仪温度降至25℃后备用。3杂交反应：向上述离心管中加入预先混合好的3μL杂交混合液1.5μL混合探针+1.5μLMLPA缓冲液，充分混匀，杂交程序为95℃，1min，60℃左右适宜温度下孵育16h，待仪器温度降至54℃。4连接反应：加入预先混合好的32μL连接混合液体系3μLLigaseBufferA+3μLLigaseBufferB+1μLLigase-65+25μLddH2O，54℃15min，98℃5min灭活，冷却至20℃。5PCR扩增反应：PCR反应体系包括7.5μLddH2O+2μLSALSAPCR-PrimerMix+0.5μLSALSApolymerase，充分混匀，加入离心管中，设置PCR程序为95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃20min，停留在15℃。其中通用引物与实施例2相同。6结果检测：反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳观察特异性条带，将具有特异性条带的样品进行毛细管电泳检测，使用GeneMarkerV2.4.0软件分析MLPA实验图谱，结果如图4所示。从图中可看出，在约94bp、100bp和108bp处均存在明显目的扩增峰，说明该中药材同时受到三种毒源真菌的污染。序列表湖北省药品监督检验研究院一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针及其应用11SIPOSequenceListing1.0146DNA人工序列Artificialsequence1gggttccctaagggttggatgatgagatcagcctccacgaagcttt46246DNA人工序列Artificialsequence2ggagaaactcacccttgacactctctagattggatcttgctggcac46354DNA人工序列Artificialsequence3gggttccctaagggttggattgtatgatctgacccaacagtcggttcggcagtt54456DNA人工序列Artificialsequence4ttcgcacatcttctcgccaggagagtggagtgttctagattggatcttgctggcac56550DNA人工序列Artificialsequence5gggttccctaagggttggatcgaatgcattattcctgctacccatatcaa50652DNA人工序列Artificialsequence6ccaggatggtcgcagcatgggtatcacgatctagattggatcttgctggcac52719DNA人工序列Artificialsequence7gggttccctaagggttgga19823DNA人工序列Artificialsequence8gtgccagcaagatccaatctaga239269DNA黄曲霉菌Aspergillusflavus9attcgacatactgaacatgggtaatataactatagggaagccaacgccttcatgatggat60gtggcctatgggtacacgattgcgccgcatggaaaagatgagttgtatgatctgacccaa120cagtcggttcggcagttttcgcacatcttctcgccaggagagtggagtgtcaatttcttc180ccgatatgtgagaagacctacataaaaggttccggcaaatgctgattctggggcagtgcg240atacgtaccatcctggttccccggagcct26910142DNA赭曲霉菌Aspergillusochraceus10tgagtatgctgtcgccgcacggccgcagtcgtatgtgggatgccggcgcagatggctacg60cgcgtggcgaaggtgtcgcagccgtagccctcaagcgactcagcgacgctatcgccgacg120gcgacgctatcgaatgcattat1421195DNA三线镰刀菌Fusariumtricinctum11ttctacaaggaatttgacgatgagctgatgagatcagcctccacgaagctttggagaaac60tcacccttgacactcaaagaccctcaggtgatgga95

权利要求：1.一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA探针，其特征在于：所述探针共有三组，每组探针分别由左侧探针LPO和右侧探针RPO组成，其中，第一组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，用于检测三线镰刀菌；第二组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列，用于检测黄曲霉菌；第三组探针的左侧探针LPO具有如SEQIDNO：5所示的核苷酸序列，右侧探针RPO具有如SEQIDNO：6所示的核苷酸序列，用于检测赭曲霉菌。2.一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA方法，其特征在于包括以下步骤：1提取待测中药材的真菌基因组DNA；2将权利要求1所述的MLPA探针与真菌基因组DNA进行杂交；3利用通用引物对步骤2的杂交产物进行PCR扩增；4对PCR扩增产物进行检测。3.如权利要求2所述的同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA方法，其特征在于：所述通用引物的上游引物和下游引物分别具有如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的核苷酸序列。4.如权利要求2所述的同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA方法，其特征在于：步骤4中，使用毛细管电泳对PCR扩增产物进行检测，若108bp处有扩增峰，则中药材存在黄曲霉菌污染；若94bp处有扩增峰，则中药材存在三线镰刀菌污染；若100bp处有扩增峰，则中药材存在赭曲霉菌污染。5.一种同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA试剂盒，其特征在于：含有杂交混合液，连接混合液和通用引物，所述杂交混合液中含有权利要求1所述的MLPA探针。6.如权利要求4所述的同时检测中药材三种毒源真菌污染的MLPA试剂盒，其特征在于：所述通用引物的上游引物和下游引物分别具有如SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示的核苷酸序列。

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