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申请/专利权人：山东中医药大学

摘要：本发明公开了一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，涉及中药材生物活性检测技术领域，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验，在中医药中，藏青果和诃子是两种不同的中药，二者均来源于使君子科植物诃子，藏青果是未成熟果实，诃子是成熟果实，筛选结果表明，诃子和藏青果均具有抗甲型流感病毒的活性，诃子酸和诃黎勒酸能够通过抑制病毒神经氨酸酶介导的后代病毒粒子的释放从而抑制甲型流感病毒的释放，且药效效力几乎不受替代作用的影响，是对抗流感病毒的很好的抗病毒候选者，从而对中药中的抗病毒药物品类进行了补充，增加医生和病患对抗流感病毒中药的选择使用。

主权项：1.诃子酸和诃黎勒酸在制备耐达菲株甲型流感病毒H1N1pdm09的药物应用。

全文数据：中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法技术领域本发明涉及中药材生物活性检测技术领域，具体为一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法。背景技术流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。此外在人类出现的各种流感中，易感人群都是儿童，所以更需要儿童流感的防治。中药抗流感具有很多优势，一是在抗病毒同时，许多药物兼有解热、抗炎等作用，对病毒引起的感染具有多重作用，如缩短发热的时间、控制炎症的扩散、促进炎症的吸收等，即多途径、多方位起作用；二是在抗病毒同时，部分药物还能增强机体免疫功能，阻止病毒进入细胞组织；三是在抗病毒同时，一般很少伤害正常组织细胞，毒副作用较小；四是由于中药采取的是个体化的治疗，对病情更具有针对性。正是由于这种治疗过程中中药有效成分的多元化，病毒难以对其产生抗药性，使得中药在治疗病毒感染性疾病方面具有明显的优势，临床使用前景广阔。本专利意在从中药中筛选新的潜在的抗病毒药物，增加医生和病患对抗流感病毒中药的选择使用。发明内容一解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明提供了一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，筛选结果表明，诃子和藏青果均具有抗甲型流感病毒的活性。二技术方案为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验。所述高通量筛选过程为：用带有报告基因的重组流感PR8-PB2-Gluc对352种中药水提物进行高通量筛选，白色96孔板每孔铺104个细胞，24小时后，用重组流感病毒PR8-PB2-Gluc以moi＝0.01感染细胞，同时用中药进行干预，设置健康对照组和流感阴性对照组，孵育36小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性，筛选出抑制率90％的中药，筛选出的单体从100uM开始，3倍稀释，做8个稀释度，利用GraphPadPrism软件，通过拟合剂量依赖性曲线得出单体的IC50和CC50；所述病毒释放抑制实验过程为：为了确定中药和其已知成分是否可以抑制后代病毒粒子的释放，PR8-PB2-Gluc病毒以MOI＝0.1感染MDCK细胞，12小时后，吸弃掉原有培养液，PBS洗3遍，换为新鲜的含有不同浓度药物和2ugmLTPCK-trypsin的Opti-MEM，孵育2小时后，收集上清液，并检测上清液中的荧光素酶活性；所述神经氨酸酶抑制实验过程为：在不同浓度的待测中药或单体的存在下，将神经氨酸酶和神经氨酸酶底物孵育，1小时后，检测荧光信号的强度，激发波长为322nm，发射波长为450nm，荧光信号的下降程度即表示神经氨酸酶抑制效果；所述病毒滴度降低实验过程为：将MDCK细胞铺于24孔板中，用耐达菲株甲型流感病毒H1N1pdm09以MOI＝0.01感染，用不同浓度的待测药物进行干预，36小时后，收集上清液，用MDCK细胞检测上清液中的病毒滴度TCID50mL。优选的，所述高通量筛选过程中对于初次筛选出的中药，利用重组流感PR8-PB2-Gluc进行验证，同时在48小时检测细胞毒性。优选的，所述神经氨酸酶抑制实验中使用的是神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒，按照试剂盒的使用说明对药物进行筛选。三有益效果本发明的有益效果在于：在中医药中，藏青果和诃子是两种不同的中药，二者均来源于使君子科植物诃子，藏青果是未成熟果实，诃子是成熟果实，筛选结果表明，诃子和藏青果均具有抗甲型流感病毒的活性，诃子酸和诃黎勒酸能够通过抑制病毒神经氨酸酶介导的后代病毒粒子的释放从而抑制甲型流感病毒的释放，且药效效力几乎不受替代作用的影响，是对抗流感病毒的很好的抗病毒候选者，从而对中药中的抗病毒药物品类进行了补充，增加医生和病患对抗流感病毒中药的选择使用。附图说明图1为本发明藏青果和诃子的抗流感活性示意图；图2为本发明诃子酸和诃黎勒酸作为新的抗流感活性单体实验结果示意图；图3为本发明诃子酸和诃黎勒酸阻断神经氨酸酶介导的病毒释放实验结果示意图；图4为本发明诃黎勒酸和诃子酸和对照品奥司他韦酸对病毒复制的剂量反应曲线实验结果示意图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。如图1-4所示，本发明提供一种技术方案：一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验。所述高通量筛选过程为：用带有报告基因的重组流感PR8-PB2-Gluc对352种中药水提物进行高通量筛选，白色96孔板每孔铺104个细胞，24小时后，用重组流感病毒PR8-PB2-Gluc以moi＝0.01感染细胞，同时用中药进行干预，设置健康对照组和流感阴性对照组，孵育36小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性，筛选出抑制率90％的中药，对于初次筛选出的中药，利用重组流感PR8-PB2-Gluc进行验证，同时在48小时检测细胞毒性，筛选出的单体从100uM开始，3倍稀释，做8个稀释度，利用GraphPadPrism软件，通过拟合剂量依赖性曲线得出单体的IC50和CC50；所述病毒释放抑制实验过程为：为了确定中药和其已知成分是否可以抑制后代病毒粒子的释放，PR8-PB2-Gluc病毒以MOI＝0.1感染MDCK细胞，12小时后，吸弃掉原有培养液，PBS洗3遍，换为新鲜的含有不同浓度药物和2ugmLTPCK-trypsin的Opti-MEM，孵育2小时后，收集上清液，并检测上清液中的荧光素酶活性；所述神经氨酸酶抑制实验过程为：实验中使用的是神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒，按照试剂盒的使用说明对药物进行筛选，在不同浓度的待测中药或单体的存在下，将神经氨酸酶和神经氨酸酶底物孵育，1小时后，检测荧光信号的强度，激发波长为322nm，发射波长为450nm，荧光信号的下降程度即表示神经氨酸酶抑制效果；所述病毒滴度降低实验过程为：将MDCK细胞铺于24孔板中，用耐达菲株甲型流感病毒H1N1pdm09以MOI＝0.01感染，用不同浓度的待测药物进行干预，36小时后，收集上清液，用MDCK细胞检测上清液中的病毒滴度TCID50mL。实施例：1、中药抗流感的筛选：为了从中药中筛选新的潜在的抗病毒药物，在实验中筛选了352种中药。选取了抑制率90％的中药做了进一步的分析研究，从中筛选出了10种具有抗甲型流感病毒活性的中药，在中医药中，藏青果和诃子是两种不同的中药，二者均来源于使君子科植物诃子，藏青果是未成熟果实，诃子是成熟果实。筛选结果表明，诃子和藏青果均具有抗甲型流感病毒的活性；如图1所示，藏青果A和诃子B的体外抗流感的剂量依赖曲线红色和对MDCK细胞的细胞毒性蓝色。数据为平均值±标准偏差，每个实验重复3次n＝3。2种中药的抗甲型流感病毒活性：表中：IC50为50％抑制浓度；CC50为50％细胞毒性浓度；SI为选择指数。2、诃子酸和诃黎勒酸抑制甲型流感病毒的复制：为了确定诃子和西青果的抗流感病毒的单体成分，从中药单体库中选择15个已知的共有单体成分，以12.5uM的终浓度进行了抗流感活性筛选。诃子酸、诃黎勒酸和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的抑制率90％。1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖已有文献报道其具有抗流感活性，诃子酸和诃黎勒酸的IC50分别为1.49uM和1.82uM，二者在实验所用最高浓度100uM下，均无明显的药物毒性，该实验结果表明，诃子酸和诃黎勒酸均可作为抗流感病毒的候选药物；如图2所示，A检测了在12.5uM的药物浓度下，来源于诃子的15种单体的抗流感活性，B诃黎勒酸和C诃子酸抗流感的体外剂量依赖关系红色和细胞毒性蓝色，数据是平均值±标准偏差，每个实验重复3次n＝3。3、诃子酸和诃黎勒酸通过抑制病毒神经氨酸酶的活性来阻断病毒的释放：如图3所示，与阳性对照药磷酸奥司他韦效果相同，诃子酸和诃黎勒酸以剂量依赖的方式抑制病毒粒子的释放。可知，流感病毒的神经氨酸酶有助于后代病毒粒子从宿主细胞的表面释放。通过荧光标准曲线法研究两个单体是否是通过抑制病毒神经氨酸酶的活性从而抑制子代病毒粒子的释放，结果表明诃子酸和诃黎勒酸能够抑制神经氨酸酶的活性，且该抑制效果呈剂量依赖性图3B，综上，诃子酸和诃黎勒酸能够通过抑制病毒神经氨酸酶介导的后代病毒粒子的释放从而抑制甲型流感病毒的释放；图3中，A病毒释放抑制实验，MDCK细胞以MOI＝1感染PR8-PB2-Gluc。12小时后，PBS洗3遍，换为含有不同浓度的待测药物以及2ugmL的Opti-MEM，孵育2小时后，收集上清液，用荧光素酶法检测上清液中的病毒含量。数据是平均值±标准偏差，每个实验重复3次n＝3，**代表p0.01，***代表p0.001，检验方法为t检验，B神经氨酸酶抑制实验。在诃子酸和诃黎勒酸存在下，神经氨酸酶和荧光底物孵育，1小时后，检测荧光强度以此判断神经氨酸酶活性，数据为平均值±标准偏差，每个实验重复3次n＝3，**代表p0.01，***代表p0.001，检验方法为t检验。4、诃子酸和诃黎勒酸抗流感病毒谱的研究：为了更好地评价诃黎勒酸和诃子酸的抗病毒效力，对3个实验室菌株进行了减产分析，包括AH1N1PR8、AH3N2NY和含有突变NAH274Y的奥司他韦耐药AH1N1PDM09，如图4所示，诃黎勒酸、诃子酸以及参比化合物奥司他韦酸对甲型流感病毒株H1N1-PR8和H3N2-NY具有相似的抑制作用。对于H1N1-PR8，诃黎勒酸1.26μm和诃子酸1.58μm的IC90s甚至低于上市的奥司他韦3.92μm；图中，24个孔板MDCK细胞在0.01的MOI感染了aaH1N1pr8，baH3N2ny和c奥司他韦耐药流感病毒aH1N1PDM09，感染后24小时收集培养上清液，用MDCK细胞测定培养上清液中的病毒滴度TCID50ml，每个点代表三个独立实验的平均值和标准偏差。综合上述数据表明，诃黎勒酸和诃子酸是对抗流感病毒的很好的抗病毒候选者，此外，还可以假设诃黎勒酸和诃子酸作为NA抑制剂的作用机制与奥司他韦不同。以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验，其特征在于：所述高通量筛选过程为：用带有报告基因的重组流感PR8-PB2-Gluc对352种中药水提物进行高通量筛选，白色96孔板每孔铺104个细胞，24小时后，用重组流感病毒PR8-PB2-Gluc以moi＝0.01感染细胞，同时用中药进行干预，设置健康对照组和流感阴性对照组，孵育36小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性，筛选出抑制率90％的中药，筛选出的单体从100uM开始，3倍稀释，做8个稀释度，利用GraphPadPrism软件，通过拟合剂量依赖性曲线得出单体的IC50和CC50；所述病毒释放抑制实验过程为：为了确定中药和其已知成分是否可以抑制后代病毒粒子的释放，PR8-PB2-Gluc病毒以MOI＝0.1感染MDCK细胞，12小时后，吸弃掉原有培养液，PBS洗3遍，换为新鲜的含有不同浓度药物和2ugmLTPCK-trypsin的Opti-MEM，孵育2小时后，收集上清液，并检测上清液中的荧光素酶活性；所述神经氨酸酶抑制实验过程为：在不同浓度的待测中药或单体的存在下，将神经氨酸酶和神经氨酸酶底物孵育，1小时后，检测荧光信号的强度，激发波长为322nm，发射波长为450nm，荧光信号的下降程度即表示神经氨酸酶抑制效果；所述病毒滴度降低实验过程为：将MDCK细胞铺于24孔板中，用耐达菲株甲型流感病毒H1N1pdm09以MOI＝0.01感染，用不同浓度的待测药物进行干预，36小时后，收集上清液，用MDCK细胞检测上清液中的病毒滴度TCID50mL。2.根据权利要求1所述的中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，其特征在于：所述高通量筛选过程中对于初次筛选出的中药，利用重组流感PR8-PB2-Gluc进行验证，同时在48小时检测细胞毒性。3.根据权利要求1所述的中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，其特征在于：所述神经氨酸酶抑制实验中使用的是神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒，按照试剂盒的使用说明对药物进行筛选。

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