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申请/专利权人：贵州大学

摘要：本发明公开了一种白鹤芋叶柄组织培养方法，该方法为：以白鹤芋的叶柄为外植体，通过消毒清洗、愈伤组织培养、愈伤分化培养、生根培养获得白鹤芋。能够获得生长良好、生产成本低的白鹤芋，且生根培养在无糖培养基中，生根诱导率为100%，为工厂化生产节约成本提供技术支撑。

主权项：1.一种白鹤芋叶柄组织培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株，母株为白鹤芋幼嫩叶柄；（2）用棉球清理掉叶柄上的杂质，并对叶柄进行清洗消毒，清洗消毒：加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75%酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次0.1%HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍；（3）经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段12处切一小刀，深度为叶柄直径的13-12，将叶柄接种至培养基MS+6-BA1mgL+NAA0.5mgL+琼脂6gL+蔗糖30gL中诱导愈伤组织，培养条件为暗培养，25±2℃；（4）叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基为MS+3.0mgL6-BA+0.1mgLNAA+琼脂6gL+蔗糖30gL，培养条件为光培养、光照时间12hd、光照强度100%、培养温度25±2℃；（5）选取步骤（4）中生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基为12MS+IBA0.5mgL+0.5gLAC，培养条件为：100%光照强度，16hd。

全文数据：一种白鹤芋叶柄组织培养方法技术领域本发明涉及一种白鹤芋叶柄组织培养方法，属于白鹤芋叶柄组织培养技术领域。背景技术白鹤芋学名：Spathiphyllumkochii为天南星科白鹤芋属植物，别名：白掌、一帆风顺和苞叶芋；其深绿的叶片和洁白的佛焰苞显得格外清新优雅，是较好的观叶观花植物；还能吸收空气中的甲醛、氨气和笨等有毒气体具有净化空气的功效，是适合室内养殖的花卉。然而现有的分株繁殖为常规繁殖方式，阻碍了优良品种的推广和新品种的开发。现有的技术也有主要围绕白鹤芋的顶芽和茎尖进行扩繁技术的研究，取得了很好的成果。但并未记载对白鹤芋叶柄的培养技术。发明内容本发明要解决的技术问题是：提供一种白鹤芋叶柄组织培养方法，以解决上述现有技术中存在的问题。本发明采取的技术方案为：一种白鹤芋叶柄组织培养方法，该方法包括以下步骤：1于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株，母株为白鹤芋幼嫩叶柄；2用棉球清理掉叶柄上的杂质，并对叶柄进行清洗消毒；3经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段12处切一小刀，深度为叶柄直径的13-12，以增加伤口的表面积利于愈伤组织的诱导，将叶柄接种至MS培养基中，该MS培养基添加6-BA、NAA、琼脂6gL和蔗糖30gL，培养条件为暗培养，25±2℃；4叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基以MS为基本培养基，添加6-BA、NAA琼脂6gL和蔗糖30gL，培养条件为光培养、光照时间12hd、光照强度100％、培养温度25±2℃；5选取步骤4中生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基以12MS为基本培养基，培养基中添加激素IBA0.5mgL，培养条件为：100％光照强度，16hd。优选的，上述步骤2中清洗消毒：加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75％酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次0.1％HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍。优选的，上述步骤3中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1mgL、0.5mgL、6gL和30gL。优选的，上述步骤4中愈伤分化培养基添加的6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为3.0mgL、0.1mgL、6gL和30gL。本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明以白鹤芋的叶柄为外植体，通过消毒清洗、愈伤组织培养、愈伤分化培养、生根培养获得白鹤芋，能够获得生长良好、生产成本低的白鹤芋，愈伤组织培养的MS培养机中添加6-BA1mgL、NAA0.5mgL、琼脂6gL和蔗糖30gL，能够让白鹤芋愈伤组织诱导率最高达86.67％，愈伤分化培养的培养基中添加6-BA3mgL、NAA0.1mgL、琼脂6gL和蔗糖30gL，能够让白鹤芋愈伤分化芽数量能够达到31个，生根培养在无糖培养基中，丛生芽在10天左右分化出根原基，生根诱导率为100％，为工厂化生产节约成本提供技术支撑。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明进行进一步介绍。实施例1：一种白鹤芋叶柄组织培养方法，该方法包括以下步骤：1于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株，母株为白鹤芋幼嫩叶柄；2用棉球清理掉叶柄上的杂质，并对叶柄进行清洗消毒；3经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段12处切一小刀以增加伤口的表面积利于愈伤组织的诱导，将叶柄接种至MS培养基中，该MS培养基添加6-BA、NAA、琼脂6gL和蔗糖30gL，培养条件为暗培养，25±2℃；4叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基以MS为基本培养基，添加6-BA、NAA琼脂6gL和蔗糖30gL，培养条件为光培养、光照时间12hd、光照强度100％、培养温度25±2℃；5选取步骤4中生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基以12MS为基本培养基，培养基中添加激素IBA0.5mgL，培养条件为：100％光照强度，16hd。优选的，上述步骤2中清洗消毒：加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75％酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次0.1％HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍。优选的，上述步骤3中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1mgL、0.5mgL、6gL和30gL。优选的，上述步骤4中愈伤分化培养基添加的6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为3.0mgL、0.1mgL、6gL和30gL。为了进一步说明本发明的效果，进行如下实验：试验材料与方法1.1试验材料试验材料在内蒙古赤峰市天鑫花卉繁育基地12号白鹤芋培育大棚于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株。试验材料为白鹤芋幼嫩叶柄，现采现用。1.2试验方法1.2.1材料的消毒方法采集回实验室的材料用棉球清理掉叶柄上的杂质。加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75％酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次0.1％HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍。1.2.2不同激素对叶柄愈伤组织的诱导经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段12处切一小刀以增加伤口的表面积利于愈伤组织的诱导，将叶柄接种至MS培养基中，培养基中添加6-BA1.0mgL、2.0mgL、NAA0.1mgL、0.2mgL、0.5mgL，共6个处理，每个处理60个外植体，每个处理附加琼脂6gL、蔗糖30gL。培养条件为暗培养，25±2℃。每隔7d观察一遍并记录叶柄愈伤组织诱导情况。1.2.3叶柄愈伤组织的分化叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，以MS为基本培养基设置6-BA1.0mgL、2.0mgL、3.0mgL和NAA0.1mgL、0.2mgL6组激素水平；附加琼脂6gL、蔗糖30gL进行组合试验。培养条件为光培养、光照时间12hd、光照强度100％、培养温度25±2℃。每隔7d观察一次，记录愈伤分化情况。1.2.4丛生芽的无糖生根培养选取生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基以12MS为基本培养基，添加0.5gL的活性炭1空白试验：培养基中不添加激素和蔗糖；2无糖培养：培养基中无蔗糖有激素IBA0.5mgL；3有糖培养：培养基中添加蔗糖30gL激素IBA0.5mgL。每个处理接种60个芽。培养条件为：100％光照强度，16hd。30d后统计苗的根长、根数及生根数等。2结果与分析2.16-BA与NAA组合对叶柄愈伤组织诱导的影响叶柄在初代培养基培养10d左右，在伤口处陆续膨大；30d左右愈伤组织呈小米状、排列紧密。愈伤在诱导前期，愈伤量较少表1，通过表1可看出，在同一6-BA浓度下，随着NAA浓度的升高而升高，且具有显著性差异P0.05；在同一NAA浓度下，6-BA浓度为1mgL较2mgL愈伤组织诱导率高。当6-BA浓度为1mgL，NAA浓度为0.5mgL时，愈伤组织诱导率最高达86.67％，且愈伤量较多。所以选取MS+6-BA1.0mgL+NAA0.5mgL为适宜叶柄愈伤组织诱导培养基。然而，愈伤组织需经过2次继代，才能获得大量的愈伤组织。表16-BA与NAA组合对愈伤组织诱导的影响2.2不同激素水平对愈伤组织分化的影响叶柄愈伤组织转移至分化培养基中，前期愈伤组织分化芽较少，随着培养时间的增加愈伤组织不断分化，同时芽丛也不断的增殖。并且每组处理的分化芽均叶片翠绿，长势良好。从表2可以得出，在同一NAA浓度下，随着6-BA浓度的增加，愈伤组织的芽丛分化数也随之增加；当6-BA浓度为3.0mgL，NAA浓度为0.1mgL时，愈伤分化芽数量最高为31个。因此，选取MS+6-BA3.0mgL+NAA0.1mgL为愈伤组织增殖分化培养基。表26-BA与NAA组合对愈伤组织分化的影响处理6-BAmgLNAAmgL接种愈伤数个愈伤分化芽均数株11.00.1201721.00.2201432.00.1202242.00.2202753.00.1203163.00.220292.3无糖培养对丛生芽生根的影响将芽丛切下成单株，接种至培养基中进行生根诱导，在CK处理中，丛生芽在第15天分化出根原基，在第30天，丛生芽生根率为93.3％，平均根数为4.46条，平均根长为1.98cm，但叶片由原先的翠绿色变微黄色，但生长势良好；在有糖培养基中，丛生芽在第10天左右分化出根原基，且分化芽诱导率为100％，平均根数为5.97条，平均根长为2.38cm，叶片浓绿，生长良好；在无糖培养基中，丛生芽在10天左右分化出根原基，生根诱导率为100％，平均根数为5.5条，平均根长为2.44cm，叶片泛黄，生长良好。从数据可得，丛生芽的生根诱导率受生长素的影响，并且叶片的颜色深度与碳源有着密切的联系，但试管苗经过炼苗移栽后，从生长情况观察没有明显差异。可见，无糖生根诱导可为规模化生产，节约生产成本提供参考意见。表3无糖培养对丛生芽生根的影响3结论与讨论试验以叶柄作为外植体，筛选出MS+6-BA1.0mgL+NAA0.5mgL+琼脂6gL+蔗糖30gL为适宜愈伤组织培养基；而MS+6-BA3mgL+NAA0.1mgL+琼脂6gL+蔗糖30gL为愈伤分化培养基，分化芽数达30以上；然而丛生芽在无糖培养基中的生根诱导率为100％，且生长良好，在生产上可节约成本，所以选MS+IBA0.5mgL不添加蔗糖的培养基作为丛生芽的生根培养基。本试验在生根阶段研究无糖条件下对试管苗生根的影响，得出在适当外界条件下，培养基中不添加碳源丛生芽的生根率能达到100％且生长良好，为工厂化生产降低生产成本提供可靠的技术参考。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

权利要求：1.一种白鹤芋叶柄组织培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：（1）于早7点至早9点采集生长健壮、叶片翠绿和无病虫害的母株，母株为白鹤芋幼嫩叶柄；（2）用棉球清理掉叶柄上的杂质，并对叶柄进行清洗消毒；（3）经消毒处理的叶柄用刀片切成约1cm长的节段，然后在茎节段12处切一小刀，深度为叶柄直径的13-12，将叶柄接种至MS培养基中，该MS培养基添加6-BA、NAA、琼脂6gL和蔗糖30gL，培养条件为暗培养，25±2℃；（4）叶柄愈伤组织经过在原培养基中继代30d后，转接至愈伤分化培养基中，愈伤分化培养基以MS为基本培养基，添加6-BA、NAA琼脂6gL和蔗糖30gL，培养条件为光培养、光照时间12hd、光照强度100%、培养温度25±2℃；（5）选取步骤（4）中生长一致，生长良好长至2cm的分化苗进行生根诱导，生根培养基以12MS为基本培养基，培养基中添加激素IBA0.5mgL，培养条件为：100%光照强度，16hd。2.根据权利要求1所述的一种白鹤芋叶柄组织培养方法，其特征在于：步骤（2）中清洗消毒：加入4滴洗洁精冲洗清洗叶片再在自来水下冲洗半小时；首先用75%酒精处理30s，无菌水清洗两遍，其次0.1%HgCl2处理6min，无菌水清洗4遍。3.根据权利要求1所述的一种白鹤芋叶柄组织培养方法，其特征在于：步骤（3）中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1mgL、0.5mgL、6gL和30gL。4.根据权利要求1所述的一种白鹤芋叶柄组织培养方法，其特征在于：步骤（4）中愈伤分化培养基添加的6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为3.0mgL、0.1mgL、6gL和30gL。

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