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申请/专利权人：杭州市农业科学研究院
摘要：本发明公开了一种用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，包括：步骤1、以草莓花雌蕊作为样品；步骤2、蛋白提取；步骤3、蛋白酶解；最终得冻干肽段。本发明还同时提供了利用上述任一方法所得的冻干肽段进行的质谱鉴定。本发明通过加入氯仿抽提水层提高蛋白提取率；氯仿也为蛋白变性剂，虽然其变性能力弱于酚，但其能溶解酚而不溶于水，因此通过氯仿能将水层中残留的酚和蛋白萃取至氯仿层。采用本发明的方法，在2小时梯度内3次技术重复共鉴定到红颊草莓雌蕊蛋白5697个。
主权项：1.一种适用于质谱鉴定的草莓雌蕊蛋白提取方法，包括：步骤1、以草莓花雌蕊作为样品；步骤2、蛋白提取；步骤3、蛋白酶解；其特征是：所述步骤2依次包括以下步骤：2.1、在0.2g样品中加入800±50μl预冷的提取液Ⅰ混匀，再加入800±50μl预冷的提取液Ⅱ进行首次抽提，得到溶液层以及位于底部的细胞沉淀；所述溶液层分为3层，从上至下依次为酚层、中间层和水层；所述提取液Ⅰ：含0.7M蔗糖、0.1M氯化钾、0.5MTris、2％巯基乙醇和50mMEDTA的水溶液，调pH至8.0；所述提取液Ⅱ：苯酚在Tris-HCl缓冲液中充分饱和的溶液；2.2、在步骤2.1首次抽提所得的酚层中加入600±50μl提取液Ⅰ进行二次抽提，得二次抽提酚层；2.3、在步骤2.1首次抽提所得的中间层和水层中加入800±50μl氯仿进行抽提；去除抽提所产生的水层，将抽提所产生的中间层和位于最下层的氯仿层与上述步骤2.2所得的二次抽提酚层进行合并；在所得的合并液中，加入6±1ml预冷的0.1M醋酸铵甲醇，于-18～-22℃静置12～16小时，离心后弃上清；所得的沉淀经预冷的甲醇清洗，冻干，得蛋白粉；所述步骤2.1、步骤2.2、步骤2.3的抽提均为：冰上颠倒混匀30±5min，于3～5℃离心；2.4、在步骤2.3所得的蛋白粉中加入400±50μL裂解液，涡旋后超声，使蛋白粉溶解，所得的溶解液离心，取上清为蛋白溶液；所述裂解液为：8M尿素，0.1MTris-HCl，1mMPMSF，调pH至8.0。
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