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申请/专利权人：湖北大学

摘要：本发明公开了一株多功能水拉恩氏菌MEM40及其应用，属于微生物技术领域，其分类学命名为水拉恩氏菌RahnellaaquatilisMEM40，保藏编号为CCTCCNO.M2018463。该菌株具有高效解磷、固氮的功能，可提高土壤中作物生长需要的有效磷含量和氮元素含量，且分泌的IAA能够促进作物生长，且该菌能产生多种土壤酶加快土壤中的物质和能力代谢，进而提高土壤肥力，改善土壤状态，促进作物生长，并减少肥料使用，尤其是磷肥和氮肥，降低种植成本。

主权项：1.一株多功能水拉恩氏菌RahnellaaquatilisMEM40，其保藏编号为CCTCCNO.M2018463。

全文数据：一株多功能水拉恩氏菌MEM40及其应用技术领域本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株多功能水拉恩氏菌MEM40及其应用。背景技术磷是作物生长所必需的营养元素之一。我国土壤中绝大部分磷元素都是以难溶性磷酸盐的形式存在，其化学性质稳定，很难被作物吸收利用，为满足作物对营养元素的需求，我国绝大部分的耕地都要大量追施磷肥来增加土壤有效磷的含量，但是施加到土壤中的无机磷会和土壤中的金属离子结合，形成难溶性磷酸盐，导致磷肥利用率低；且磷肥的滥用不仅造成资源浪费，同时也会带来严重的环境问题，比如土壤板结、酸化、地力衰退、农产品品质降低、土壤微生物数量减少、生态恶化、耕地土壤生态系统失衡等。因此，改善和提高我国耕作田土壤中营养元素的利用率意义重大。在土壤、植物根际或植物组织内存在大量的微生物，其中具有防病、促生或提高植物抗逆功能的菌株，在提高肥料利用率，减少化学农药的使用方面具有广阔应用前景，逐渐成为研究与开发热点，但从目前报导的文献看，目前开发应用的菌株大多功能单一，土壤存活率不高，因此，在实际应用中，一般是将多种不同功能的高效菌株混合制成复合菌剂去生产生物肥料，但是复合菌存在微生物间的拮抗作用，不同菌株营养需求也不尽相同等问题，从而给实际应用造成了诸多不便。因此，筛选获得具有广谱特性的野生微生物菌株仍然具有重大意义。发明内容本发明的目的在于提供一株多功能水拉恩氏菌MEM40及其应用，提供一株高效解磷、固氮、分泌生长素和多种土壤酶的水拉恩氏菌MEM40，在减少化肥使用量，提高土壤肥效，促进作物生长等方面具有很好地发展前景。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：本发明提供了一株多功能水拉恩氏菌MEM40，该菌株已于2018年7月11日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCM2018463，保藏地址：武汉市武昌珞珈山，分类学命名为水拉恩氏菌RahnellaaquatilisMEM40。水拉恩氏菌RahnellaaquatilisMEM40在LB固体培养基上30℃培养24h，菌落呈乳白色，不透明，表面光滑、湿润、隆起，边缘齐整，显微镜下观察，细胞大小为0.9-1.0μm×1.5-2.0μm，呈近球形短杆状，两端钝圆，两侧平行，革兰氏染色阴性、不产芽孢、胞内无异染粒和类脂颗粒；MEM40可在1～8％的NaCl浓度范围内生长，接触酶阳性，氧化酶阴性，赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶阴性，精氨酸双水解酶阳性，苯丙氨酸脱氨酶弱阳性，可利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、水苏糖、肌苷、D-丝氨酸、D-山梨醇、D-甘露醇等，不能利用3-甲基-D-葡萄糖、D-岩藻糖、果胶，具有醋竹桃霉素、利福霉素、二甲胺四环素、万古霉素、氨曲南、林可霉素抗性；16srDNA测序分析发现，MEM40与RahnellaaquatilisCIP78.65T的序列相似性最高，进化树分析显示MEM40与Rahnellaaquatilis聚集在同一分支，所述的水拉恩氏菌MEM40的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示；基于细胞形态、生理生化、16SrDNA序列多项分析，MEM40归属于水拉恩氏菌Rahnellaaquatilis。本发明提供了一种多功能水拉恩氏菌MEM40在植物促生长中的应用。进一步的，所述植物为小白菜，添加MEM40组的小白菜鲜重增加了51.41％；株高增加了23.92％；根长增加了26.02％。本发明提供了一种多功能水拉恩氏菌MEM40在解难溶性无机磷中的应用。进一步的，所述难溶性无机磷为磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉中的一种；溶解磷酸钙时，可溶性磷含量可达299.545mgL；溶解磷酸镁时，可溶性磷含量可达411.56mgL；溶解磷矿粉时，可溶性磷含量可达289.42mgL。本发明提供了一种多功能水拉恩氏菌MEM40在解有机磷中的应用，其对卵磷脂有较好的降解能力，在大豆卵磷脂培养基培养30h，溶液中可溶磷含量可达28.47mgL。本发明提供了一种多功能水拉恩氏菌MEM40在固氮中的应用，该菌株在Nfb培养基培养15d后，溶液中总氮含量可达23.478mgL。本发明提供了一种多功能水拉恩氏菌MEM40在产吲哚乙酸中的应用，在色氨酸培养基培养24h，此时菌株产IAA的量达到24.93mgL。本发明的有益效果是：1.本发明提供的水拉恩氏菌MEM40具有高效解磷、固氮的功能，可提高土壤中作物生长需要的有效磷含量和氮元素含量，且分泌的吲哚乙酸IAA能够促进作物生长，且该菌能产生多种土壤酶加快土壤中的物质和能力代谢，进而提高土壤肥力，改善土壤状态，促进作物生长，并减少肥料使用，尤其是磷肥和氮肥，降低种植成本。2.本发明提供的水拉恩氏菌MEM40具有同时解无机磷和有机磷的能力，可以全面的将土壤中难溶态的磷转化为可供植物直接吸收利用形式的磷，提高土壤有效磷和有机质含量，在改善土壤供磷性能、磷的转化方面前景良好，可应用于生物磷肥和植物促生长等农业领域。3.本发明提供的水拉恩氏菌MEM40具备多种促生能力，解决了多菌种植物生长促进剂中存在的菌种间拮抗和营养需求不一致的问题，促生长效果更好。4.本发明提供的水拉恩氏菌MEM40分离自土壤，为土著菌，将其施用到土壤中，虽会与土壤固有微生物竞争，但只是短暂的，最终将共生在一个体系中，其施用对环境是无害的。5本发明提供的水拉恩氏菌MEM40培养条件及方法简便易行，生产工艺和设备要求低。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1MEM40菌落形态A和芽孢染色B图。图2MEM40系统进化树，Mycobacteriumgenavense2289作为外类群；图3MEM40的解磷量随时间的变化图；图4MEM40降解卵磷脂效果图A和降解卵磷脂曲线B；图5MEM40在Nfb平板上的生长状况；A大肠杆菌阴性对照，B固氮菌20024阳性对照，CMEM40，D甲基营养型芽胞杆菌阳性对照；图6MEM40分泌的IAA量随时间的变化图。图7MEM40对小白菜促生长结果图。具体实施方式下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例涉及到的培养基配方及试剂组分如下：1难溶无机磷培养基PKO培养基：葡萄糖10g、酵母粉0.5g、NH42SO40.5g、NaCl0.3g、KCl0.3g、MgSO4·7H2O0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·H2O0.03g、难溶性磷源5.0g、去离子水1L，pH7.0-7.2固体培养基加琼脂20g，115℃灭菌20min后备用。2大豆卵磷脂培养基：葡萄糖10g、KCl0.3g、NaCl0.3g、NH42SO40.5g、FeSO4·7H2O0.03g、CaCO35g、MnSO4·4H2O0.03g、大豆卵磷脂2g，蒸馏水定容至1L，自然pH，115℃灭菌30min。3无氮培养基Nfb:苹果酸5g，KOH4.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.02g，NaCl0.1g，溴百里酚蓝2mL，Fe3-EDTA1.64％4mL，维生素溶液VB6200mgL-1，生物素100mgL-11mL，微量元素CuSO40.4g-1，ZnSO40.12g-1，H2BO31.4g-1，二水钼酸钠1g-1，MnSO41.5g-12mL。4改良阿氏无氮液体培养基：蔗糖10g、K2HPO40.2g、K2SO40.2g、MgSO4·7H2O0.2g、NaCl0.2g、CaCO35g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，121℃灭菌30min。5L-色氨酸培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，PH7.4，灭菌后用细菌过滤器加入L-色氨酸至浓度100mgL。6Salkowski显色液：50mL35％HClO4+1mL0.5molLFeCl3。实施例1MEM40的筛选鉴定一、采用富集培养法从土壤分离得到，具体如下：从湖北某磷化工厂周边采集10g土样，加入到灭菌的PKO培养基富集培养，随后涂布于PKO平板上，挑取平板上解磷圈较大的菌落进行多次分离纯化，得到本发明的菌株，记为MEM40。二、观察菌株形态特征，具体如下：将纯化的菌接种于LB培养基过夜活化，划线于LB固体培养基，30℃培养24h，观察菌落的表面形态，革兰氏染色观察菌株的显微形态。三、对菌株生理生化性质进行鉴定：生理生化分析包括碳源利用、产酸实验由北京宝杰罗生物科技有限公司测定。四、对菌株16SrRNA基因测序，具体如下：以MEM40菌株的基因组DNA为模板，通用引物1492R和27F扩增16SrDNA序列，纯化后插入到pMD18-T载体Takara，转化到E.coliDH5α，得到的阳性克隆送往武汉擎科生物技术有限公司测序,将测序得到的序列与在线软件EzBioCloud'sIdentifyService模块的EzTaxon-ehttp:www.ezbiocloud.netidentify中细菌数据库序列进行同源比对分析，使用MEGA4.1软件，以N-J法进行聚类分析和系统进化树的构建，重复取样1000次，并且运用自展Bootstrap法检验所计算的进化树拓扑结构稳定性，发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。引物序列如下：1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。菌株MEM40的具体鉴定信息如下：形态特征：在LB固体培养基上30℃培养24h，菌落呈乳白色，表面光滑、湿润、隆起，边缘齐整，显微镜下观察，细胞大小为0.9-1.0μm×1.5-2.0μm，呈近球形短杆状，两端钝圆，两侧平行，革兰氏染色阴性、不产芽孢、胞内无异染粒和类脂颗粒，见图1。生理生化性质：MEM40可在1～8％的NaCl浓度范围内生长，接触酶阳性，氧化酶阴性，赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶阴性，精氨酸双水解酶阳性，苯丙氨酸脱氨酶弱阳性，可利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、水苏糖、肌苷、D-丝氨酸、D-山梨醇、D-甘露醇等作为碳源，不能利用3-甲基-D-葡萄糖、D-岩藻糖、果胶，具有醋竹桃霉素、利福霉素、二甲胺四环素、万古霉素、氨曲南、林可霉素抗性，具体生理生化指标的试验结果如表1所示。表1菌株MEM40的生理生化特征注：+阳性，W弱阳性，-阴性；16srDNA测序：扩增的16srDNA由1420bp组成，同源比对分析发现，MEM40与RahnellaaquatilisCIP78.65T的序列相似性为99.65％，与RahnellaoryzaeJ11-6T的序列相似性为98.52％，与RahnellabruchiFRB226T的序列相似性为98.14％。进化树分析显示MEM40与Rahnellaaquatilis聚集在同一分支，见图2。基于细胞形态、生理生化、16SrDNA序列多项分析，MEM40归属于水拉恩氏菌Rahnellaaquatilis。实施例2水拉恩氏菌MEM40的解无机磷效果实验将过夜活化的MEM40菌液接种至200mLPKO培养基中，30℃、150rpm恒温振荡培养，每隔一段时间取样4mL，10000rpm离心8min。按照国标法GB11893-89-钼锑抗比色法测定可溶性磷含量，以不接种菌液的培养基作为对照，MEM40解磷能力结果见图3。由图可知，在0-8h，MEM40处于适应期，溶磷量较低，12h后，菌株处于对数生长期，溶解难溶性无机磷能力逐步增加，在32h时，MEM40溶解磷酸钙和磷酸镁的量达到最大，溶液中可溶性磷含量分别达到299.5453mgL和411.56mgL；在24h时，MEM40溶解磷矿粉的量达到最大，溶液中可溶性磷含量为289.42mgL，之后随着营养物质的减少，菌体活力下降甚至死亡，溶液中可溶性磷含量逐渐降低。本实验结果表明，MEM40能够速效溶解土壤中难溶性磷酸盐如磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉，以提高土壤中有效磷含量，供于作物吸收利用，可减少磷肥的使用量，并可改善土壤肥效。实施例3水拉恩氏菌MEM40解有机磷效果实验将过夜活化的MEM40菌液点样至大豆卵磷脂平板，28℃恒温倒置培养3d，观察菌落周围是否出现明显解磷圈。将过夜活化的MEM40接种至含200mL大豆卵磷脂液体培养基的锥形瓶中，28℃、150rpm恒温振荡培养，每隔一段时间取样，8000rpm离心5min，采用钼锑抗比色法测定可溶磷的含量，每个处理重复三次，以不接菌液作为对照。由图4A可知，卵磷脂平板上MEM40周围出现明显水解圈，说明其具有降解卵磷脂的能力，卵磷脂被MEM40分泌的磷酸酶水解为甘油、脂肪酸、磷酸和胆碱，胆碱进一步分解为胺、二氧化碳、有机酸和醇，从而使得卵磷脂平板上培养的菌体能在其周围形成一定的透明圈，其透明圈直径大小与菌株产酶利用卵磷脂的能力呈正相关关系，透明圈大而亮说明MEM40解有机磷的能力较强。根据图4B的降解卵磷脂曲线可知，在0-8h时，MEM40解磷量降低；在12-30h时候，溶液中可溶磷含量迅速增加，并在30h溶液中可溶磷含量最大，为28.47mgL；之后溶液中可溶磷含量降低；表明MEM40可以利用有机磷并将其降解为可溶磷，因此，MEM40可将土壤中难溶性有机磷转换成可供植物吸收利用的磷，增加土壤中有效磷的含量，促进作物生长。实施例4水拉恩氏菌MEM40的固氮效果实验将过夜活化的MEM40菌液离心，菌体沉淀用灭菌的PBS洗2-3次，随后划线于Nfb平板，28℃恒温倒置培养3d，能够在Nfb平板上正常生长的菌株为备选的固氮菌菌株，测定其固氮能力，以无固氮能力的大肠杆菌为阴性对照，以在中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC购买的固氮菌为阳性对照。将MEM40按2％的接种量接种于改良阿氏无氮液体培养基中，28℃、180rpm培养15d，取菌液过滤，以不接菌作为对照，将样品送往经南京卡文斯生物技术有限公司检测，测定原理参照国标HJ636-2012。由平板结果见图5可知，MEM40在Nfb培养基生长良好，具有一定的固氮能力；培养15d后，溶液中总氮含量为23.478mgL，表明菌株MEM40具有将空气的氮还原成氨的能力，氨遇水变为铵根，成为植物可以吸收利用的氮，因此，MEM40能够提高土壤中氮元素的含量，增加土壤肥效，促进作物生长，减少氮肥使用，降低种植成本。实施例5水拉恩氏菌MEM40的分泌IAA效果实验将过夜活化的MEM40菌液接种至200mLL-色氨酸培养基中，30℃、180rpm恒温振荡培养，每隔一段时间取样，8000rpm离心3min，取上清液3mL与等体积Salkowski显色液混合，室温下避光放置30min，测定OD530，以蒸馏水与Salkowski比色液的1:1混合液为空白对照，根据IAA标准曲线计算上清液中IAA含量；同时，取沉淀用等体积去离子水悬浮，测定OD600，表征菌株的生长情况。菌液与显色液混合后呈粉红色，说明菌株MEM40具有产IAA的能力，由图6可知，在0-24h，MEM40生长活跃，快速进入对数期，其产生的IAA含量也随时间延长不断提高，并于24h达到最大值，此时菌株产IAA的量达到24.93mgL，34h后菌株生长进入稳定期，产IAA的能力也相应有所下降；可知，菌株产IAA的能力与菌株生长相适应一致，在24h后，菌株生长量缓慢下降，但是产IAA的能力却迅速下降，则是因为培养基营养耗尽，菌体活力降低导致，此后一部分菌体死亡、自溶，释放出营养物质，供新生菌体生长繁殖，菌体活力有所上升，因此产IAA能力缓慢上升。实施例6水拉恩氏菌MEM40在促进小白菜生长中的应用提前一周取若干小白菜种子进行催芽，在幼苗开始“拉十字”时进行分苗，选取粗壮的、生长状况较好的幼苗移栽入装有经过研磨的土壤中，每盆中栽种3株长势、大小类似的幼苗。移栽苗后放置于28℃、12h光照-12h黑暗的光照培养箱中培养，进行浇水等日常管理。以移栽当天的时间记为0d，每隔7d对照组施加清水，实验组施加MEM40发酵液。35d后，测量植株的鲜重、株高及根长，从而确定MEM40促生长效果。由图7可知，MEM40对小白菜生长具有较好的促生长作用，相比对照组，使用MEM40发酵液的小白菜鲜重增加了51.41％；株高增加了23.92％；根长增加了26.02％，具体结果如表2所示。表2MEM40促进小白菜生长实验结果从自然环境中分离高效解无机磷和有机磷的菌株是提高土壤肥效的基础和保证，土壤难溶性的无机磷向可溶性磷的转化和有机磷的生物矿化对植物磷的营养需要十分重要。本申请从土壤中分离到一株水拉恩氏菌MEM40，该菌可以高效溶解难溶性无机磷，如磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉，同时又具有良好的分解有机磷的能力，因而可以全面的将土壤中难溶态的磷转化为可供植物直接吸收利用形式的磷，提高土壤有效磷的含量和有机质含量，促进作物生长；根据我们调研的资料，没有关于水拉恩氏菌可以同时解难溶性无机磷和有机磷的报道，大多微生物只在其中一个方面起作用，并且效果受环境的影响较大，本申请丰富了解磷菌的种质资源，该菌株具有同时难溶性无机磷和有机磷的能力，在改善土壤供磷性能、磷的转化方面前景良好，可应用于生物磷肥和植物促生长等农业领域；而且，MEM40具有良好的固氮能力，还能产生天然生长素吲哚乙酸，促进植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成，这也拓宽了解磷菌在促进作物生长领域的应用，不仅用于提高土壤有效磷含量，还可提高土壤氮肥含量，在通过增强土壤肥效促进作物生长的同时，还可分泌吲哚乙酸促进作物生长，更好的提高作物品质和产量。MEM40在具备多种促生能力的同时解决了多菌种植物生长促进剂中存在的菌种间拮抗和营养需求不一致的问题。更重要的是，MEM40分离自土壤，为土著菌，将其施用到土壤中，虽会与土壤固有微生物竞争，但只是短暂的，最终将共生在一个体系中，其施用对环境是无害的。综上，本申请获得一株高效解磷、固氮、分泌生长素的水拉恩氏菌MEM40，可将其应用于生物肥料和植物促生长等农业领域，减少化肥使用量，尤其是磷肥和氮肥，提高土壤肥效，促进作物生长。序列表湖北大学一株多功能水拉恩氏菌MEM40及其应用1SIPOSequenceListing1.011420DNA水拉恩氏菌Rahnellaaquatilisgene1..14201acacatgcagtcgagcggcagcggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgg60gtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaa120taccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtg180cccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctg240gtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggc300agcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaa360gaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcacacttaatacgtg420tggtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggta480atacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttg540ttaagtcagatgtgaaatccccgcgcttaacgtgggaactgcatttgaaactggcaagct600agagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgga660ggaataccggtggcgaaggcggccccttggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgt720ggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaaacgatgtcgacttgga780ggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagt840acggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatg900tggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccacggaattcgcc960agagatggcttagtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctc1020gtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccag1080cacgtaatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatg1140acgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatataca1200aagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattgg1260agtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacg1320gtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaa1380agaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccactt1420

权利要求：1.一株多功能水拉恩氏菌MEM40，其特征在于，分类学命名为水拉恩氏菌RahnellaaquatilisMEM40，其保藏编号为CCTCCNO.M2018463。2.如权利要求1所述的多功能水拉恩氏菌MEM40在植物促生长中的应用。3.如权利要求2所述的多功能水拉恩氏菌MEM40在植物促生长中的应用，所述植物为小白菜。4.如权利要求1所述的多功能水拉恩氏菌MEM40在解难溶性无机磷中的应用。5.如权利要求4所述的多功能水拉恩氏菌MEM40在解难溶性无机磷中的应用，其特征在于：所述难溶性无机磷为磷酸钙、磷酸镁和磷矿粉中的一种。6.如权利要求1所述的多功能水拉恩氏菌MEM40在解有机磷中的应用。7.如权利要求1所述的多功能水拉恩氏菌MEM40在固氮中的应用。8.如权利要求1所述的多功能水拉恩氏菌MEM40在产吲哚乙酸中的应用。

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