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申请/专利权人：中国农业科学院特产研究所

摘要：本发明公开了犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用。本发明以犬瘟热病毒CDV‑3株为模板，将CDV‑3的全长分5个片段进行RT‑PCR扩增。经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体，同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列，获得犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆。然后，构建表达CDV‑3N、P、L蛋白的三个辅助质粒。将犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T细胞，获得拯救后的重组CDV‑3病毒rCDV‑3。研究发现，获得的rCDV‑3病毒滴度最高达到107.667TCID50mL，比wtCDV‑3高出10倍。rCDV‑3感染Vero细胞后，于感染后36h迅速达到最高病毒滴度，而wtCDV‑3于感染后72h时病毒含量达到最高。本发明的提出为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究奠定了基础。

主权项：1.一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取冻存的犬瘟热病毒CDV-3株细胞培养悬液，提取总RNA，反转录合成cDNA；（2）将CDV-3的全长cDNA分成5个片段进行RT-PCR扩增，扩增产物依次命名为：F1、F2、F3、F4和F5，其中，用于扩增F1片段的引物为QF1-F以及QF1-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.1以及SEQIDNO.2所示，用于扩增F2片段的引物为QF2-F以及QF2-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.3以及SEQIDNO.4所示，用于扩增F3片段的引物为QF3-F以及QF3-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.5以及SEQIDNO.6所示，用于扩增F4片段的引物为QF4-F以及QF4-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.7以及SEQIDNO.8所示，用于扩增F5片段的引物为QF5-F以及QF5-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.9以及SEQIDNO.10所示；（3）经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体中，获得克隆有CDV-3株全长cDNA的质粒，即犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆;所述的CDV-3株全长cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；其中，步骤（3）中所述的真核载体为改造后的真核载体pcDNA3.1，pcDNA3.1通过以下步骤进行改造：用内切酶PmeI酶切pcDNA3.1，回收大片段后，与事先制备的双链DNA连接，其中所述的双链DNA的上链如SEQIDNO.11所示，所述的双链DNA的下链如SEQIDNO.12所示，得到改造后真核载体pcDNA3.1，改造后的真核载体pcDNA3.1中多克隆位点变为NheI-NotI-BsiwI-Bsp1407I-CpoI-部分丁型肝炎核酶序列，改造后的pcDNA3.1称为pcDNA3.2。

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