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申请/专利权人：南阳师范学院

摘要：本发明公开了一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1、构建及应用，pBD1质粒的构建，利用PCR、酶切、酶连、测序、转化等多种分子生物学手段，在芽孢杆菌表达载体pHY300p1k的基础上，构建了一个含有IPTG诱导型的Pgrac启动子、dCas9及sgRNA的质粒pHY300‑dCas9‑sgRNApBD1，因为质粒的启动子强度大、有广泛的宿主范围，因而，理论上该质粒适用于广泛的芽孢杆菌。

主权项：1.一种芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，其中含有IPTG诱导型的Pgrac启动子、dCas9及sgRNA。

全文数据：一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1、构建及应用技术领域本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1的构建方法及应用。背景技术随着分子克隆技术日渐成熟，对一些重要基因的功能研究依赖于基因敲减技术。基因敲减是一种反向的遗传学研宄方法，通过一定途径从分子水平上将机体特定的基因缺失或者失活或者表达水平降低，对比表观性状的变化，从而了解该基因的功能，该方法在医学、生物学等许多研究领域都具有极其重要的理论和实践意义。人们首次基于同源重组建立了完整的胚胎干细胞基因敲除的小鼠模型，而后同源重组成为对特定基因实现敲减的主要方式。同源重组基因敲减法包括含重组敲除片段的载体构建、外源DNA的转化、标记基因的选用及筛选三个基本步骤。在进行敲减时，要尽可能少的改变细胞本身基因组，因此外源载体应该具备易清除的特点，人们最早设计了自杀载体来满足这种要求，自杀载体是在特定的细胞中不含有复制子，不能复制扩增，随着细胞的传代逐渐丢失，现在还有人在使用自杀载体通过同源重组敲减掉基因，但这并不是最佳的方法。随之出现的是RNA干扰RNAi，即利用具有同源性的双链RNAdsRNA诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因的活性。但敲减效率也往往是RNAi的一个软肋。然后，在发现锌指蛋白能特异性识别DNA的基础上产生了锌指核糖核酸酶ZFN技术，ZFN由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，但据报道，ZFN的脱靶效率会比较高，所以这项技术的完善也还有很长的路要走。后来在ZFN的基础上诞生了TALENtranscriptionactivator-likeeffectornucleases技术。研究者们利用来自XamthomonasTAL的序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因，敲除该基因功能。TALEN技术成功解决了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影戏那个识别特性的问题，使基因敲除变得简单方便。在蛋白识别DNA的理论基础上，最新的就是CRISPRclustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats技术。CRISPR是最近几年才发现的原生生物中的调控RNA，是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白Cas蛋白共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPRCas9系统应用最为广泛。CRISPR-CAS9系统主要是由Cas9蛋白、precursorCRISPRRNApre-crRNA和trans-activatingcrRNAtracrRNA三部分组成。其中，crRNA与tracrRNA形成嵌合RNA分子，即单向导RNASingleguideRNA,sgRNA。sgRNA可以介导Cas9蛋白在特定PAM序列处进行切割，形成DNA双链断裂Double-StrandedBreak,DSB，完成基因定向编辑等的各类操作。由于PAM序列结构简单5’-NGG-3’，几乎可以在所有的基因中都能找到大量靶点，因此已被改造成有力的基因工程工具并在近两年中如狂风骤雨般横扫整个基因工程领域。2014年，Qi等人在《Cell》上发表论文，将Cas9的核酸内切酶活性位点突变，形成无活性的dCas9deadCas9，当dCas9与sgRNA共表达时，可特异性的阻止转录延长因子，RNA聚合酶的结合，抑制转录，从而有效的降低了目的基因的表达。可见，CRISPRdCas9系统已成为目前最高效的基因组敲低系统。发明内容针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1、构建及应用。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1的构建方法，包括如下步骤：S1Pveg-SapI-sgRNA模块的搭建设计引物Pveg-F-XbaI和Pveg-R，以质粒psb1c3-pveg-RBS-dCas9-b0015为模板，扩增获得芽孢杆菌组成型表达的启动子Pveg；其中质粒psb1c3-pveg-RBS-dCas9-b0015的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，而引物Pveg-F-XbaI和Pveg-R序列如下：Pveg-F-XbaIGCTCTAGAGGAGTTCTGAGAATTGGTATGPveg-RACATTTATTGTACAACACGAGCC将两条引物sgRNA-SapI-F和sgRNA-SapI-R进行退火，获得长度为73bp的SapIbox区域；sgRNA-SapI-F和sgRNA-SapI-R的序列如下：将引物PsgRNA-F和PsgRNA-R-HindIII也进行退火，获得3’端携带HindIII酶切位点的长度为82bp的sgRNA片段；PsgRNA-FGTTTTAGAGCTAGAAATAGCPsgRNA-R-HindIIICCCAAGCTTAAAAAAGCACCGACTCGGTGC分别将以上的启动子Pveg、SapIbox区域和sgRNA片段进行PCR，切胶回收，进行Slice产物PCR；最终获得长度为357nt的含启动子Pveg的sgRNA表达框最终序列，即Pveg-SapI-sgRNA模块；S2pBD1质粒的构建分别将质粒pHY300-Pgrac和步骤S1构建得到的Pveg-SapI-sgRNA模块用限制性内切酶HindIII和XbaI进行双酶切，回收，将两个回收产物用连接酶连接，获得质粒pHY300-Pgrac-SapI-sgRNA；扩增dCas9，用BglII酶切，装入载体质粒pHY300-Pgrac-SapI-sgRNA，并用酶切或PCR的方法验证基因插入方向的正确性，获得质粒pHY300-dCas9-sgRNA,即为芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1。需要说明的是，步骤S2中，所述扩增dCas9采用的引物如下：dCas9-F-BglIIGAAGATCTATGGATAAGAAATACTCAATAGdCas9-R-BglIIGAAGATCTTCAGTCACCTCCTAGCTGACTC。需要说明的是，步骤S2中，所述用酶切的方法验证基因插入方向的正确性的方法为：BamHI单切，在基因插入方向的正确的情况下，如果是正向插入，会切出一条3.5k的片段，如果是反向插入，则会切出一条905bp的片段；需要说明的是，步骤S2中，所述用PCR的方法验证基因插入方向的正确性的方法为：用引物RT-R和pHY300-pgrac上的引物seq-R进行PCR，如果扩出正确条带463bp,即可说明插入方向正确，质粒构建成功；其中：RT-RTTTGATACTGTGGCGGTCSeq-RGGAATCATTGTCATTAGTTGGCTG。一种采用上述构建方法得到的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1在芽孢杆菌中的应用，具体为：以芽孢杆菌为宿主，其中包含有所述芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1。采用构建方法得到的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，其中含有IPTG诱导型的Pgrac启动子、dCas9及sgRNA。本发明的有益效果在于：本申请利用PCR、酶切、酶连、测序、转化等多种分子生物学手段，在芽孢杆菌表达载体pHY300plk的基础上，构建了一个含有IPTG诱导型的Pgrac启动子、dCas9及sgRNA的质粒pHY300-dCas9-sgRNA，因为质粒的启动子强度大、有广泛的宿主范围，因而，理论上该质粒适用于广泛的芽孢杆菌。设计杀线虫芽孢杆菌B.nematocidaB16中主要毒力因子丝氨酸蛋白酶基因bace16的sgRNA，利用质粒pHY300-dCas9-sgRNA成功获得了bace16的敲减突变株，并且在无诱导物IPTG情况下，蛋白酶bace16的表达基本回复到野生型水平，表明了质粒pHY300-dCas9-sgRNApBD1可在mRNA水平上降低并回补目的基因的表达来研究基因的功能。该系统的可逆性。本研究结果为研究芽胞杆菌的重要代谢和调控机制、防病机理等的重要基因的功能提供了有力的工具。跟常用的自杀质粒相比，本发明所构建的质粒的优势在于：1不用知道靶标基因的上下游序列；2构建载体简洁、快速：只需要在非模板链“NGG”处设计一段20nt的引物片段，退火，用SapI酶切，与载体连接即可，省去了很多步骤。本发明质粒的整体水平分析优点在于：操作简单，只需要在靶基因起始位点或启动子附近设计一段特异的20nt的序列，退火后插入构建好的载体即可；该质粒对基因的敲低或互补均为可逆控制。因为dCas9的表达是受启动子Pgrac调控，该启动子是IPTG诱导型的，因而通过控制IPTG的浓度来控制基因的表达；高度特异。对非靶基因的表达无影响；可同时调控多基因的表达；设计对应不同靶DNA的20nt的序列组成不同的sgRNA，将这些不同模块的sgRNA串联，在dCas9表达量足够大时实现多个靶基因的敲低和互补。附图说明图1为本发明质粒pBD1的构建流程说明图；图2-8分别为图1中由上至下各部分放大示意图。图9为本发明质粒pBD1可行性验证时杀线虫芽孢杆菌bace16基因的表达情况示意图。具体实施方式以下将结合附图对本实用新型作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实用新型的保护范围并不限于本实施例。如图1-8所示，一种基于dCas9的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1的构建方法，包括如下步骤：S1Pveg-SapI-sgRNA模块的搭建设计引物Pveg-F-XbaI和Pveg-R，以质粒psb1c3-pveg-RBS-dCas9-b0015为模板，扩增获得芽孢杆菌组成型表达的启动子Pveg；其中质粒psb1c3-pveg-RBS-dCas9-b0015的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，而引物Pveg-F-XbaI和Pveg-R序列如下：设计引物Pveg-F-XbaI和Pveg-R，以中国科学技术大学孙宝林研究组构建好的质粒pPDB为模板，扩增获得芽孢杆菌组成型表达的启动子Pveg；其中Pveg-F-XbaI和Pveg-R序列如下：Pveg-F-XbaIGCTCTAGAGGAGTTCTGAGAATTGGTATGPveg-RACATTTATTGTACAACACGAGCC质粒psb1c3-pveg-RBS-dCas9-b0015pPDB由中国科学技术大学孙宝林研究组构建，具体由孙宝林教授的学生赵长隆构建，dCas9购于addgene公司。将两条引物sgRNA-SapI-F和sgRNA-SapI-R进行退火，获得长度为73bp的SapIbox区域；sgRNA-SapI-F和sgRNA-SapI-R的序列如下：将引物PsgRNA-F和PsgRNA-R-HindIII也进行退火，获得3’端携带HindIII酶切位点的长度为82bp的sgRNA片段；PsgRNA-FGTTTTAGAGCTAGAAATAGCPsgRNA-R-HindIIICCCAAGCTTAAAAAAGCACCGACTCGGTGC分别将以上的启动子Pveg、SapIbox区域和sgRNA片段进行PCR，切胶回收，进行Slice产物PCR；最终获得长度为357nt的含启动子Pveg的sgRNA表达框最终序列，即Pveg-SapI-sgRNA模块；S2pBD1质粒的构建分别将质粒pHY300-Pgrac购自ViewsolidBiotechCo.Ltd，北京唯尚立德生物科技有限公司和步骤S1构建得到的Pveg-SapI-sgRNA模块用限制性内切酶HindIII和XbaI进行双酶切，回收，将两个回收产物用连接酶连接，获得质粒pHY300-Pgrac-SapI-sgRNA；扩增dCas9dCas9购于addgene公司，用BglII酶切，装入载体质粒pHY300-Pgrac-SapI-sgRNA，并用酶切或PCR的方法验证基因插入方向的正确性，获得质粒pHY300-dCas9-sgRNA,即pBD1。扩增dCas9采用的引物如下：dCas9-F-BglIIGAAGATCTATGGATAAGAAATACTCAATAGdCas9-R-BglIIGAAGATCTTCAGTCACCTCCTAGCTGACTC所述用酶切或PCR的方法验证基因插入方向的正确性的方法为：酶切验证:BamHI单切，如果是正向插入，应该切出一条3.5k的片段，如果是反向插入的话，应该是905bp。PCR验证：用引物RT-R和pHY300-pgrac上的引物seq-R去PCR，如果扩出正确条带463bp,即可说明插入方向正确，质粒构建成功。其中：RT-RTTTGATACTGTGGCGGTCSeq-RGGAATCATTGTCATTAGTTGGCTG采用上述构建方法得到的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1能够在广泛的芽孢杆菌中的应用。通过上述构建方法得到的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，其中含有IPTG诱导型的Pgrac启动子、dCas9及sgRNA。以下将对质粒pBD1的可行性作进一步的验证。质粒pBD1-bace16的构建验证实验中采用的细菌是杀线虫芽孢杆菌BacillusnematocidaB16菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏日期：2004年4月5日；保藏登记入册编号CGMCCNo.1128。在杀线虫芽孢杆菌B16的毒性丝氨酸蛋白酶基因bace16的5’起始端，距离GTG78nt的位置，此处基因组中含有NGG的非特异配对结合区，设计一对靶向bace16的sgRNA的引物oligo1,oligo2。将该对引物退火后，与质粒pBD1连接，获得目标质粒pBD1-bace16。oligo1TGTGATTTCCCTGCCGCCTGGGColigo2AACGCCCAGGCGGCAGGGAAATC2、杀线虫芽孢杆菌B16感受态的制备与电转化杀线虫芽孢杆菌B16电转感受态的制备方法如下：将菌液在37℃培养至OD600值约为0.3，然后将菌液转移至预冷的离心管，离心，用等体积预冷的0.5M蔗糖重悬菌体，再用12体积预冷的0.5M蔗糖重悬沉淀，冰上放置30min。离心10min，收集细胞。最后，用2ml预冷的0.5M蔗糖重悬沉淀。迅速将细胞分装成100μl小份，-80℃贮存备用。电转化参数为用：电压2.5kV；电容50μF；电阻200欧姆。电击之后，立即加入800μlTSB培养基，静置5-10min。37℃振荡培养复苏60min。将适当体积复苏的感受态细胞涂布于抗性平板。待液体被吸收后，倒置平皿，于37℃培养，16-24小时后可出现菌落。3、基因bace16的表达分析转化子在四环素抗性平板出现后，将其转移到含有IPTG的LB液体培养基中进行培养，获得基因敲减菌株B16Δbace16。同时，将转化子接入不含IPTG的培养基中培养，此时菌株为回复菌株CB16Δbace16。将菌株B16Δbace16和CB16Δbace16进行发酵，在相同菌密度时，取150μl的发酵液，利用打孔器将发酵液加入脱脂牛奶平板进行培养，通过水解圈的强弱观察bace16的表达情况。同时，根据以前文章报道的方法Niuetal.,2006；2007；2010，将两种发酵液测试杀线虫活性进一步确定毒力因子bace16的表达状况。采用Casein干酪素平板检测，用打孔器在平板上打孔，在孔中加入200微升的待测样品如发酵液，并把平板放于37℃培养箱中孵化2-10小时，观察透明圈的产生和大小，透明圈的大小和样品的蛋白酶活性呈正相关，如图9所示。结果表明，与野生型B16相比，bace16的敲低突变株在无IPTG诱导时，蛋白酶Bace16的表达量与野生型没有差别，分别在0.3mMIPTG,0.6mMIPTG,1.0mMIPTG诱导时，Bace16的表达量依次减弱，充分说明本发明构建的敲低质粒在Bacillus中可以成功应用。表1为本发明所用到的引物序列表1表2为本发明所用到的相关菌种和质粒表2对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

权利要求：1.一种芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，其中含有IPTG诱导型的Pgrac启动子、dCas9及sgRNA。2.一种采用权利要求1所述的芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1在芽孢杆菌中的应用，其特征在于，以芽孢杆菌为宿主，其中包含有所述芽孢杆菌基因敲低载体质粒pBD1。

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