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申请/专利权人：伊莱利利公司

摘要：提供了特异性结合7种人ELR+ CXC趋化因子的抗体。本发明的抗体可用于治疗多种炎症性自身免疫性疾病，诸如炎性肠病（IBD）、牛皮癣和掌跖脓疱病；和癌症，诸如肾癌或卵巢癌。

主权项：中和人Gro‑α、Gro‑β、Gro‑γ、ENA‑78、GCP‑2、NAP‑2和IL‑8的抗体。

全文数据：Pan-ELR+CXC趋化因子抗体[0001]本发明涉及针对ELR+CXC趋化因子的抗体，以及它们在治疗由ELR+CXC趋化因子介导发病的疾病中的用途。[0002]ELR+CXC趋化因子这样称谓是因为该趋化因子家族成员都具有紧邻它们的CXC基序的E-L-R氨基酸基序在各种发病机制中发挥重要作用，包括嗜中性粒细胞向炎症和血管生成位点的迀移。嗜中性粒细胞促进几种急性和慢性炎症自身免疫性疾病的发病，诸如炎性肠病（IBD、牛皮癣和掌跖脓疱病。ELR+CXC趋化因子还在肿瘤生成和肿瘤转移中发挥关键作用。这些趋化因子在肿瘤中高表达。在肿瘤环境中，ELR+CXC趋化因子涉及多个通路，例如血管生成、内皮细胞和白细胞在肿瘤部位的移动和侵袭，以及肿瘤细胞的增殖和存活。[0003]趋化因子分为4个亚家族:CXC、CC、（XC和CX3C。在CXC趋化因子中，一个氨基酸隔开前两个半胱氨酸（“CXC基序”）JLR+CXC趋化因子是CXCRl和或CXCR2趋化因子受体的配体，其是特异性结合ELR+CXC趋化因子的G-蛋白偶联的7种跨膜结构域型受体。所述7种人ELR+CXC趋化因子是人Gr〇-a也称为CXCL1、人GroK也称为CXCL2、人Gro-γ也称为CXCL3、人ENA-78也称为CXCL5、人GCP-2也称为CXCL6、人NAP-2也称为CXCL7和人IL-8也称为CXCL8。所有的ELR+CXC趋化因子都结合CXCR2受体;此外，一些ELR+CXC趋化因子结合CXCRl和CXCR2受体两者（S卩，CXCL6和CXCL8，它们都促进活化途径中的冗余。[0004]先前已经描述了结合个别ELR+CXC趋化因子的抗体。在早期的临床实验中已经评价了针对CXCL8IL-8的两种单克隆抗体在炎症疾病中具有效力〇1^1^8丨〇166:401_410;JImmunol181:669-679。此外TO2008130969公开了结合人IL-8CXCL8、人Gro-aCXCL1、人Gro-βCXCL2、人Gr〇-yCXCL3和人ENA-78CXCL5的抗体。但是，该公开没有证实该抗体紧密结合GCP-2CXCL6，并且没有提及对NAP-2CXCL7的结合。[0005]但是，尚未公开能够结合并中和所有7种人ELR+CXC趋化因子的抗体。靶向一种或一些人ELR+CXC趋化因子使得其它ELR+CXC趋化因子有机会引发多种生物学功能。中和所有7种ELR+CXC趋化因子可以影响CXCRl+或CXCR2+细胞迀移到炎症部位的能力，并且可以抑制血管生成。鉴于在CXCRl和CXCR2受体活化通路中显著的冗余，对于结合所有7种人ELR+CXC趋化因子的具有特异性和高亲和力的抗体仍然存在需要。对中和所有7种人ELR+CXC趋化因子的抗体存在需要。对于物理性能稳定的抗体也存在需要。因此，希望提供能够结合并中和所有7种人ELR+CXC趋化因子并且物理性能稳定的s印ta-特异性抗体。[0006]本发明提供了中和人Gr〇-a、Gr〇-0、Gr〇-γ4嫩-78、6〇?-2、嫩卩-2和11^-8的抗体。本发明还提供了中和Gro-a、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2和IL-8的抗体，其中所述抗体在下列氨基酸处结合IL_8SEQIDNO:27:Arg6、Ile10、Ala35、Ile40。本发明还提供了中和人Gr〇-a、Gr〇-0、Gr〇-γ4嫩-78、6〇?-2、嫩?-2和11^-8的抗体，其中所述抗体在下列氨基酸处结合IL_8SEQIDNO:27:Arg6、Ile10、Ala35、Ile40和Leu49。[0007]本发明提供了抗体，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链可变区（LCVR并且所述重链包含重链可变区（HCVR，其中所述LCVR包括LCDR1、LCDR2、LCDR3并且所述HCVR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3，其中LCDR1是RASQSISNNLHSEQIDN0:7，LCDR2是YTSRSVSSEQIDN0:8，LCDR3是GQNNEWPEVSEQIDN0:9，HCDR1是GYEFTSYWIH序列IDN0:10，HCDR2是NISPNSGSANYNEKFKSSEQIDN0:ll，并且HCDR3是EGPYSYYPSRXaaYYGSDLSEQIDN0:20，其中Xaa是E或Q。[0008]在另一方面，本发明提供了一种抗体，其中HCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:2或SEQIDNO:14。本发明还提供了一种抗体，其中LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:4或SEQIDNO:16〇[0009]本发明提供了一种抗体，其中重链的氨基酸序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:13。本发明还提供了一种抗体，其中轻链的氨基酸序列是SEQIDNO:3或SEQIDNO:15。[0010]本发明还提供了一种DNA分子，所述DNA分子包含编码具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:13的氨基酸序列多肽的第一多核苷酸序列；和包含编码具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:15的氨基酸序列多肽的第二多核苷酸序列。[0011]本发明提供了包含上述DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够表达抗体，所述抗体包含具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:13的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:15的氨基酸序列的轻链。已知能够表达功能性免疫球蛋白的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢CHO细胞、COS细胞和NSO细胞。用于本发明的优选的宿主细胞是NSO细胞。[0012]本发明进一步提供了用于生产包含氨基酸序列是SEQIDNO:3或SEQIDNO:15的轻链和氨基酸序列是SEQIDNO:1或SEQIDNO:13的重链的抗体的方法，所述方法包括在使得抗体表达的条件下培养上述哺乳动物细胞并回收表达的抗体。[0013]本发明提供一种治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的方法，包括对有需要的患者施用治疗有效量的本发明的抗体。[0014]本发明进一步提供了用于治疗的本发明的抗体。此外，本发明提供了用于治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的本发明的抗体。此外，本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的药物中的用途。[0015]本发明提供了包含本发明的抗体和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。[0016]如本文所用，术语“人ELR+CXC趋化因子”意在指具有E-L-R基序并结合CXCRGP或CXCR2受体的7种已知的CXC趋化因子。人ELR+CXC趋化因子是人Gro-α也称为CXCL1SEQIDN0:21、人Gro-M也称为CXCL2SEQIDN0:22、人Gro-γ也称为CXCL3SEQIDN0:23、AENA-78〇i^$SCXCL5SEQIDN0:24、AGCP-2ai^$SCXCL6SEQIDN0:25、人NAP-2也称为CXCL7SEQIDN0:26和人IL-8也称为CXCL8SEQIDN0:27。本文中所有7种人ELR+CXC趋化因子统称为“人pan-ELR+CXC趋化因子”。[0017]如本文所用术语“抗体”意在指包含四条多肽链（通过二硫键互相连接的两条重H链和两条轻L链）的单克隆免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区（HCVR和重链恒定区。所述重链恒定区包括三个结构域，CHl、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区（LCVL和轻链恒定区，CL13HCVR和LCVR区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区CDR，其间散布更保守的称为框架区（FR的区域。每个HCVR和LCVR由三个CDR和4个FR构成，按照下列顺序从氨基端向羧基端排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。HCVR中的CDR区称为HCDRl、HCDR2和HCDRSdLCVR中的CDR区称为LCDR1、LCDR2和LCDR3XDR包含与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。对于抗体目前有三种用于序列划分的CDR排列系统。KabatCDR定义Kabat等，“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,”NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.1991基于抗体序列可变性。ChothiaCDR定义Chothia等，“Canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins”，JournalofMolecularBiology,196,901-9171987;Al-Lazikani等，“Standardconformationsforthecanonicalstructuresofimmunoglobulins”，JournalofMolecularBiology,273，927-9481997基于抗体的三维结构和⑶R环的拓扑结构。除了HCDRl和HCDR2之外，Chothia⑶R定义与KabatCDR定义相同。对于本发明的目的，使用杂合的Kabat和Chothia定义来定义CDR。在HCVR和LCVR区中的氨基酸排列与Kabat编号规则一致。还理解术语“抗体”涵盖对抗体的任何细胞内翻译后修饰包括但不限于酰化和糖基化。[0018]如本文所用，术语“中和抗体”意在指结合ELR+CXC趋化因子导致该趋化因子诱导的生物学活性被抑制的抗体。ELR+趋化因子诱导的生物学活性的抑制可以通过一种或多种本领域已知的几种标准体外测定来进行评价参见实施例）。进一步理解，如本文所用关于本发明抗体活性的术语“抑制”或“中和”意指拮抗、降低或破坏由一种或多种ELR+CXC趋化因子诱导的生物学活性的进展、强度或严重程度的能力。[0019]如本文所用，术语“septa-特异性抗体”意在涵盖以高亲和力（例如具有从约5XHT11M至约IXHT9M范围的结合亲和力Kd结合所有7种人ELR+CXC趋化因子的抗体。[0020]如本文所用，“患者”指哺乳动物，优选具有疾病、病症或状况的人，所述疾病、病症或状况将受益于人ELR+CXC趋化因子水平的降低或由人ELR+CXC趋化因子诱导的生物活性的降低。[0021]如本文所用，“治疗”或“治疗”意在指其中可以减慢、控制或终止本文所公开的病症进展，但不必指示所有病症症状的完全消除的所有方法。治疗包括施用本发明的抗体用于治疗患者特别是人中的疾病或状况。[0022]本发明的抗体以高亲和力结合人pan-ELR+CXC趋化因子。例如，当作为全长IgG4抗体表达时，本发明抗体以下列范围中的结合亲和力Kd结合所有7种人ELR+CXC趋化因子:从约5X10_11M至约IXHT9M，例如从约1.0X10_1°M至约8.6X10_1°M，如通过表面等离子共振所测量。本发明的抗体进一步表征为，当它们特异性结合人pan-ELR+CXC趋化因子时，它们不特异性结合其它CXC趋化因子，例如基质细胞衍生因子-laSDF-la，也称为CXCLl2。[0023]在一个实施方案中，本发明的抗体可以具有重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：HCDRlSEQIDNO:10、HCDR2SEQIDNO:11和HCDR3SEQIDNO:12;并且其中所述轻链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：LCDRlSEQIDNO:7、LCDR2SEQIDNO:8和LCDR3SEQIDNO:9。[0024]在另一个实施方案中，本发明的抗体可以具有重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有下列氨基酸序列的⑶R区：HCDRlSEQIDNO:10、HCDR2SEQIDNO:11和HCDR3SEQIDNO:19;并且其中所述轻链可变区包含具有下列氨基酸序列的CDR区：LCDRlSEQIDNO:7、LCDR2SEQIDNO:8和LCDR3SEQIDNO:9。[0025]在进一步的实施方案中，本发明的抗体可以包含具有SEQIDNO:2或14的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQIDNO:4或16的氨基酸序列的轻链可变区。[0026]在又进一步的实施方案中，本发明的抗体可以包含具有SEQIDNO:1或13的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:3或15的氨基酸序列的轻链。[0027]优选地，所述抗体包含两条相同的轻链和两条相同的重链。优选地，所述具有如SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链由包含SEQIDNO:6所示多核苷酸序列的核酸编码。优选地，所述具有如SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的重链由包含SEQIDNO:5所示多核苷酸序列的核酸编码。优选地，所述如SEQIDNO:15中所示轻链氨基酸序列由包含SEQIDNO:18所示多核苷酸序列的核酸编码。优选地，所述如SEQIDNO:13中所示重链氨基酸序列由包含SEQIDNO:17所示多核苷酸序列的核酸编码。[0028]本发明最优选的实施方案是包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的两条相同重链和具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的两条相同轻链的抗体。[0029]本发明的抗体可以掺入适合用于施用给患者的药物组合物。典型地，所述药物组合物包含本发明的抗体和药学可接受的载体。如本文所用的，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体可以进一步包括微量的增强所述抗体货架期或有效性的辅助物质。[0030]本发明的组合物可以以各种形式。优选形式取决于施用和治疗应用的意向方式。典型的优选组合物以可注射或可输注溶液的形式，诸如类似于那些用于人的被动免疫的组合物。施用的优选方式是胃肠外例如，静脉内、皮下、腹膜内或肌内）。在一个实施方案中，所述抗体通过腹膜内或皮下注射施用。但是，如本领域技术人员会理解的，施用的途径和或方式会取决于所希望的结果而变化。[0031]补充的活性化合物也可以掺入药物组合物。在某些实施方案中，本发明的抗体与一种或多种可用于治疗其中ELR+CXC趋化因子活性有害的病症的额外的治疗剂共配制和或共施用。例如，本发明的抗体可以与一种或多种化疗剂（例如，舒尼替尼或顺铂）共配制和或共施用。[0032]本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”的本发明的抗体。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间阶段，有效获得需要的治疗结果的量。本发明抗体的治疗有效量可以根据因素诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述抗体在个体中引发所需应答的能力而改变。治疗有效量还是这样的量，其中治疗有益作用超出所述抗体的任何毒性或有害作用。[0033]可以调整剂量方案以提供最佳的所需应答例如，治疗应答）。例如，可以施用单次推注，可以经过一段时间施用几个分份剂量，或者可以如治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。[0034]剂量值可以随所要缓解的状况的类型和严重程度变化。进一步理解，对于任何特定受试者，应当根据个体需要和施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整特定剂量方案。[0035]本发明的抗体对人ELR+CXC趋化因子的特异性结合和中和允许所述抗体用作用于受益于人ELR+CXC趋化因子生物活性抑制的疾病和病症的治疗剂。鉴于它们结合和中和所有7种人ELR+CXC趋化因子的能力，本发明的抗体相对于靶向单个人ELR+CXC趋化因子的单一疗法和靶向多种人ELR+CXC趋化因子的组合疗法提供优势。[0036]在一个实施方案，本发明提供用于治疗溃疡性结肠炎或癌症，如肾癌或卵巢癌的方法。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗溃疡性结肠炎或癌症，如肾癌或卵巢癌的抗体。[0037]本发明通过下列非限制性实例进一步阐明。实施例[QQ38]抗体的表达和生产[0039]用于本发明的抗体可以如下表达和纯化。使用包含SEQIDNO:5编码SEQIDNO:1的重链多肽和SEQIDNO:6编码SEQIDNO:3的轻链多肽）的DNA序列的表达载体转染NSO细胞。此表达载体获得的抗体是“抗体1”。[0040]另外，使用包含SEQIDNO:17编码SEQIDNO:13的重链多肽）和SEQIDNO:18编码SEQIDNO:15的轻链多肽）的DNA序列的表达载体转染NSO细胞。此表达载体获得的抗体是“抗体2”。[0041]对于抗体1或抗体2,转染库以低密度铺板以允许长出接近单克隆的稳定表达细胞。筛选主孔的抗体表达，并且然后在无血清悬浮培养基中放大用于生产。将抗体分泌到其中的澄清的培养基施加到蛋白A或G柱，所述柱已用相容的缓冲液，诸如磷酸缓冲盐水PH7.4进行平衡。清洗柱以去除非特异性结合组分。通过pH梯度诸如0.IM磷酸钠缓冲液，pH6.8至0.IM梓檬酸钠缓冲液，pH2.5洗脱结合的抗体。通过SDS-PAGE检测抗体级分并然后合并。进一步的纯化是任选的，取决于意向的用途。可以使用常规技术浓缩和或无菌过滤抗体。可以通过常规技术有效去除可溶性聚集物和多聚体，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱。这些色谱步骤后抗体的纯度可以超过99%。产物可以立即冷冻在-70°C，或可以冻干。[0042]对人ELR+CXC趋化因子的结合亲和力[0043]使用Biacore2000设备和Biacore2000评价软件版本4.1用于表面等离子共振分析。使用制造商的EDCNHS氨基偶联方法准备CM5芯片。简而言之，通过以10yLmin注射EDCNHS的1:1混合物7分钟活化所有4个流通池的表面。蛋白A在IOmM醋酸盐，pH4.5缓冲液中稀释到1〇〇ygmL，并且通过以10yLmin的流速注射7分钟固定化到所有4个流通池上以获得约10,000RU。未反应的位点用乙醇胺以10yLmin的流速注射7分钟进行封闭。使用以10yLmin进行30秒的甘氨酸的两次注射pHl.5来去除任何非共价结合的蛋白。运行缓冲液是HBS-EP+。[0044]抗体1或抗体2在运行缓冲液中稀释到2ygmL，并且在流通池Fe中捕获大约400-600RU。配体在运行缓冲液中稀释到从100ygmL到50nM，并然后在运行缓冲液中两倍系列稀释到3.125nM。每种配体浓度的两次重复注射以100yLmin进行150秒，随后是解离期。对于所有配体，解离期是1800秒。对于所有流通池通过以50yLmin注射IOmM甘氨酸pHl.5进行60秒进行再生。参考消减的数据收集为FC2-Fcl、FC3-Fcl和Fc4-Fcl。在25°C获得测量。对于每种配体的结合-速率Aqj5和解离-速率Aaff使用“1:1质量转移结合”结合模型进行评价。根据关系Kd=AQffAan根据结合动力学计算亲和力Kd。[0045]人ELR+CXC趋化因子与抗体1和抗体2产生浓度依赖性结合应答。表1和表2总结了抗体1和抗体2的和Kd值。这些结果证实抗体1和抗体2以高亲和力结合所有7种人ELR+CXC趋化因子。[0046]表1抗体1对人ELR+CXC趋化因子的体外结合亲和力[0047][0048]表2抗体2对人ELR+CXC趋化因子的体外结合亲和力[0049][QQ5Q]物理稳定性评价[0051]在抗体中蛋白聚集和自缔合是不希望的性质，因为其可以潜在地加剧不需要的效果，诸如触发免疫应答。因此，维持抗体在单体状态是高度希望的。百分比高分子量%HMW聚集物是蛋白聚集和自缔合的指示物。更高的%HMW聚集物指示增加的蛋白聚集自缔合和增加的物理稳定性。抗体1和抗体2的物理稳定性如下确定。[0052]抗体在4°C对10mM柠檬酸盐，pH6+-150mMNaCl透析过夜。第二天早晨，将样品浓缩到50mgmL，过滤通过0.2微米过滤器，并然后添加吐温-80至0.02%的终浓度。每个样品在25°C孵育特定时间。通过分析型SEC使用直径30cmx0.78cm的TSK3000SWXL，5微米柱追踪可溶性聚集物形成。流动相是50mM磷酸钠，pH7，175mMNaCl，以0.5mLmin的流速。样品以IyL注射施加，并且在280nm监测以确定增加的%HMff聚集物表3。[0053]50mgmL制剂在25°C孵育1和4周以评价在压力条件下的长期稳定性。通过在1周或4周的时间点的%HMff，减去在时间0在表3中称为“初始”）的%!1丽聚集物来确定△%HMW聚集物。在1和4周后，抗体1和抗体2均展示A%HMW聚集物低于1%，从而展示良好的物理稳定性。[0054]表3%高分子量聚集物[0055][0056]X才于抗体1的抗体表位作图[0057]采取了多种方法来表征抗体1的表位，包括Western印迹分析、抗体与几种ELR+CXC趋化因子的共结晶以及对于结合和中和的突变分析。[0058]Western印迹分析:[0059]为了确定抗体1是否能够结合线性或构象表位，使用还原和非还原条件进行Western印迹分析。使用预制NuPAGE®4-12%Bis-Tris凝胶进行蛋白电泳。将NuPAGE®MESSDS运行缓冲液添加到mini-cells的内（200mL和外（至少600mL室中。在具有或不具有NuPAGE®IOX样品还原剂的NuPAGE®LDS4X样品缓冲液中制备人CXCL8的系列稀释每条泳道400ng、100ng或25ng。样品在95°C加热2分钟。样品的上样体积是每个泳道10μL，并且对于SeeBluePlus2预染标准标记物是每个泳道5yL。凝胶在室温下在200V运行35分钟。[0060]使用具有iBlot®TransferStack,Nitrocellulose,Mini的iBlot®干燥印迹系统将蛋白转移到PVDF上。膜在封闭缓冲液在磷酸缓冲盐水中的3%脱脂奶）中在室温下封闭1小时。将抗体1添加到封闭溶液中达到IygmL的终浓度，并且然后在室温下孵育2小时。初步孵育后，去除抗体封闭溶液，并将膜在清洗缓冲液磷酸缓冲盐水+〇.05%吐温20中15分钟清洗3次。然后将膜与HRP缀合的驴抗人Fc特异性IgG二抗0.1ygrnL在封闭液中）在室温下一起孵育1小时。去除二抗后，将膜用清洗缓冲液清洗4次，进行10分钟。然后将膜与稳定过氧化物溶液和鲁米诺增强溶液（SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate的工作溶液一起孵育5分钟。将膜置于塑料膜保护器中在X射线胶片暗盒中与CL-XPosureTM胶片一起30秒。使用KonicaSRX-IOl系统使胶片显色。[0061]在非还原条件下，在400ng的CXCL8浓度下，在约17kDa和约IOkDa出现两条条带。在IOOng的CXCL8浓度，在约IOkDa出现一条条带。在25ng的CXCL8浓度，没有出现条带。在还原条件下，在任何测试浓度都没有出现条带。[0062]结果证明抗体1能够结合非还原的变性的人CXCL8,但是不能结合还原变性的人CXCL8。因此，需要CXCL8中两个二硫键来维持抗体表位。这些结果证明了抗体1的构象表位。[0063]晶体结构分析[0064]获得了人CXCL8和食蟹猴CXCL2、CXCL3和CXCL7的Fab抗原复合物的晶体结构，以确定抗体1的完整的结合表面。野生型截短的人CXCL81-66、人CXCL8点突变体和食蟹猴CXCL7均在大肠杆菌中表达具有N端His-SUMO标签。这些蛋白是重折叠的;标签被切除;并且所述蛋白通过标准纯化技术进行纯化。食蟹猴CXCL2和CXCL3在HEK293EBNA细胞中表达并且通过标准纯化技术纯化。通过胰蛋白酶消化和质量指纹图谱分析来证实二硫键形成，并且通过中性粒细胞的趋化性试验证实活性。抗体1的Fab在HEK293EBNA细胞中表达并且通过标准纯化技术纯化。通过向Fab添加略微摩尔过量的抗原来形成Fab抗原复合物，然后进行大小排阻色谱纯化以去除过量的游离抗原。使复合物结晶，并使用Buster2.9.5GlobalPhasingLtd.通过分子置换解析晶体结构。[0065]这些晶体结构证实抗体1的表位包括ELR+CXC趋化因子的N端，但它们也显示Fab与ELR+CXC趋化因子的βΐ-β2环和β2和β3束之间的接触。晶体结构还展示抗体特异性识别ELR+CXC趋化因子的折叠，因为晶体结构是重叠的。也观察到很多的氢键和范德华力相互作用。最值得注意的是，ELR基序的保守R6侧链位于由Fab重链在残基W33，Y102,和YllO，以及Fab轻链在残基W94形成的深结合口袋中。野生型截短的人CXCL8趋化因子还与Fab重链在残基E99和Fab轻链在N91主链羰基形成氢键。在野生型截短的人CXCL8趋化因子的L5主链羰基和Fab轻链W94主链酰胺之间；野生型截短的人CXCL8趋化因子的IlO主链羰基和Fab重链S52侧链之间；野生型截短的人CXCL8趋化因子的Kll侧链和Fab重链T30和S31侧链之间；野生型截短的人CXCL8趋化因子的H33侧链和Fab轻链W94主链羰基之间;A35主链酰胺和Fab重链N59侧链之间；以及野生型截短的人CXCL8趋化因子的C50主链酰胺和Fab重链Y104主链羰基之间，观察到其它氢键。此外，野生型截短的人CXCL8趋化因子的N-端残基5至13造成与Fab的很多接触，因为N端位于Fab重链⑶R2和⑶R3之间的沟里。此外，Fab重链⑶R3环从此沟延伸并与野生型截短的人CXCL8趋化因子的β2束上的非N端残基140和β3束上的残基Glu48、Leu49和Cys50相互作用。最后，野生型截短的人CXCL8趋化因子中的β1-β2环的残基33-36相对Fab重链CDR2包裹。[0066]突变分析[0067]在晶体结构中观察到抗体IFab和野生型人CXCL8之间的几个关键接触，并且进一步通过结合动力学研究和人CXCL8点突变的U937-huCXCR2荧光成像板读板器FLIPR中和来进行测试。为了研究这些关键接触，基于人CXCL8序列（SEQIDNO:27制造了几个点突变0?64、11^、435?、14^和1^494。根据标准技术表达、重折叠和纯化野生型、1?64、11^、A35P、I40A和L49A人CXCL8点突变体。通过胰蛋白酶消化和质量指纹图谱分析来证实二硫键形成，并且通过中性粒细胞的趋化性试验证实活性。[0068]如上述，在Biacore2000设备上用Biacore2000评价软件版本4.1测试结合动力学。使用U937-huCXCR2测定来测试野生型和突变体人CXCL8的生物学活性和被抗体1的中和。U937-huCXCR2是用逆转录病毒转导的单核细胞细胞系用于表达人CXCR2。[0069]CXCL8突变体在含有0.2%BSA的测定缓冲液中系列稀释在V形底96孔聚丙烯板的孔中。配体浓度是最终测定浓度最终测定浓度范围从300至0.005InM的3倍。将细胞板和配体板加载到荧光成像板读板器FLIPR-3,MolecularDevices中，设定程序以转移50汕配体到细胞板的孔中。以1秒间隔记录荧光进行90秒。从图像10到90计算荧光变化（△相对荧光单位（DRFU,MaxRFU-MinRFU。使用GraphPadPrism，DRFU相对log配体浓度）绘图，并且通过非线性回归确定EC5q值。在三个测定板上一式三份进行测定。[0070]将抗体1系列稀释到包含0.2%BSA的测定缓冲液中。抗体浓度是最终测定浓度最终测定浓度范围从10至0.0195ygml的3倍。在测定缓冲液+0.2%BSA中制备240nM8nM的最终测定浓度的30X的野生型人CXCL8和CXCL8突变体的贮存溶液。将20此配体与180此抗体1在V形底96孔聚丙烯板的孔中混合。配体和抗体在室温下孵育30分钟。将细胞板和配体-抗体板加载到荧光成像板读板器FLIPR-3,MolecularDevices中，设定程序以转移50此配体-抗体到细胞板的孔中。以1秒间隔记录荧光进行90秒。根据图像10至90计算荧光①RFU变化。使用GraphPadPrism，DRFU相对log抗体浓度绘图，并且通过非线性回归确定IC5Q值。在三个测定板上一式三份进行测定。[0071]结合动力学、生物学活性和中和结果总结在表4中。在25°C获得测量。对于每种配体的结合-速率kon和解离-速率koff使用“1:1质量转移结合”结合模型进行评价。根据关系KD=koffkon根据结合动力学计算亲和力KD。[0072]几个突变敲除了对受体的活性EC5q并且，因此，不能测试中和。值得注意的是，A35P突变完全消除了中和活性，尽管对于受体具有完全活性。这些结果突出了CXCL8抗原结合界面内的对抗体结合重要的关键接触R6、110、A35、140和L49。[0073]表4人CXCR8野生型和突变体的结合动力学、U937FLII3R活性EC5q以及U937FLIPR中和（IC50。[0074][0075]总体上，对于抗体1的表位作图分析证明了抗原的结合界面包括ELR+CXC趋化因子氨基酸5-13、β1-β2环氨基酸33-36以及β2和β3束（氨基酸40，48-50。在此界面内的对于抗体结合重要的关键接触包括CXCL8中的氨基酸R6、I10、A35、I40和L49SEQIDN0:27。[0076]中和测定[0077]使用人CXCR2-转染的HMEC细胞的人ELR+CXC趋化因子的体外中和[0078]因为所有的ELR+CXC趋化因子可以结合CXCR2受体，所以选择表达CXCR2的细胞用于体外研究。HMEC-huCXCR2是用逆转录病毒转导的永生化的人内皮细胞系用于表达人CXCR2受体。表达人CXCR2的HMEC细胞能够诱导对人、食蟹猴、大鼠和小鼠ELR+CXC趋化因子应答的细胞内Ca2+内流。可以通过荧光成像板读板器FLIPR检测细胞内Ca2+内流。因此趋化因子中和还应该中和由这些趋化因子诱导的细胞内Ca2+内流。[0079]HMEC-huCXCR2在37°C在5%CO2中维持在补充有10%胎牛血清、2xGlutamax、lx非必需氨基酸、IygmL氢化可的松、10ngmL人类表皮生长因子，和0.4ygmL噪呤霉素的MCDB31培养基中。培养物维持在亚汇合密度50-80%汇合）。细胞用TrypLEExpress收获，在完全培养基中将细胞密度调整到3xl05细胞mL，并且将IOO1IL细胞悬浮物接种到黑色透明底测定板的孔中。细胞板在室温下孵育30分钟以允许细胞沉降到孔的底部，然后将板在37°C在5%CO2中孵育过夜。对于每个测定板，一小瓶Flu〇-4NW试剂的内容物悬浮在IOmL测定缓冲液和100PL丙磺舒中以制备lxFlu〇-4NW试剂。孵育后，吸干培养基并将100yLlxFluo-4NW溶液加入到测定板的每个孔中。板在37°C孵育30分钟，随后在室温孵育额外30分钟并避光。将抗体1系列稀释到包含〇.2%BSA的测定缓冲液中。抗体浓度是最终测定浓度最终测定浓度范围从10至0.0195ugmL的3倍。在测定缓冲液+0.2%BSA中制备300nMIOnM的最终测定浓度的30X的配体的贮存溶液。将20汕配体与180此抗体在V形底96孔聚丙烯板的孔中混合。配体和抗体在室温下孵育30分钟。将细胞板和配体-抗体板加载到荧光成像板读板器FLIPR-3,MolecularDevices中，设定程序以转移5〇uL配体-抗体到细胞板的孔中。每秒记录荧光进行90秒。根据图像10至90计算荧光DRFU变化。使用GraphPadPrism，DRFU相对log抗体浓度绘图，并且通过非线性回归确定IC5q值。在三个测定板上一式三份进行测定。数据表示为重复的平均值。[0080]结果总结在表5中。这些结果证实抗体1能够中和所有7种人ELR+CXC趋化因子。IC5Q值表示为tigmL抗体标准偏差在括号中）XXCL8的72氨基酸和77氨基酸形式均被使用。数据是2-5次重复的平均值。[0081]表5:使用表达人CXCR2的HMEC细胞的体外FLIPR研究[0082][0083]使用原代人嗜中性粒细胞的人CXCL8的体外中和作用或CXCLl诱导的趋化性[0084]选择使用人嗜中性粒细胞的趋化性测定来确定抗体在天然表达CXCRl和CXCR2两者的细胞中的中和活性。来自健康志愿者的外周血吸取到两个IOmL肝素钠管中。为了分离嗜中性粒细胞，在4个15mL管中将5mL血液对5mLPoIymorphprep分层。管以470xg在18°C离心30分钟。移除并丢弃血浆和顶部细胞带单核细胞）。合并来自4管的第二条带嗜中性粒细胞并添加等体积的I3BS。管以400xg在18°C离心10分钟。如先前用12mLPBS洗涤沉淀，并将沉淀用llmLHBSSBSA7.5mgmLBSA,HBSS重悬。将60xl06个细胞悬浮在12mLHBSSBSA和5μΜCMFDA中并在37°C孵育30分钟。孵育后，离心管以沉淀细胞，用12mLHBSSBSA洗涤一次，并然后将细胞重悬在12mLHBSSBSA5xl06细胞mL中。[0085]使用HBSSBSA将抗体1和同种型对照（人IgG4抗体稀释到1495nM稀释1并然后用HBSSBSA1:5系列稀释。用HBSSBSA将CXCL8稀释到20nM。用HBSSBSA将CXCLl稀释到IO-InM0[0086]70uL抗体1或HBSSBSA与70ULCXCL8或CXCLl溶液混合并在室温孵育约30分钟。一式三份将30yL混合物分散入ChemoTx板的下层室的孔中。仅包含HBSSBSA的孔无趋化因子或抗体将显示背景信号。ChemoTx滤器置于下层室上，并将50uL250000细胞分散到每个孔上。将ChemoTx板在37°C，5%CO2孵育3小时。孵育后，用I3BS将细胞从顶表面润洗，并去除ChemoTx滤器。仅使用底部检测器读取485535荧光WallacVictor31420计数器）。背景孔仅HBSSBSA的平均荧光从测试孔荧光减去，并且在Excel中计算平均和标准偏差。[0087]在5nM的CXCL8浓度，对于抗体lMff150,000kDa的IC5Q是26.4±0.236nM。在IOnM的CXCL8浓度，对于抗体1的IC5Q是43.7±0.086nM。在5nM的CXCLl浓度，对于抗体1的IC5Q是18.5±0.158nM。在20nM的CXCLl浓度，对于抗体1的IC5Q是40.3±0.112nM。在CXCLl和CXCL8的所有测试浓度，同种型对照抗体没有影响趋化性。数据显示抗体1可以以剂量依赖性方式阻断人CXCL8或CXCLl的趋化活性，而趋化活性不受同种型对照抗体的影响。[0088]小鼠中的体内急性DSS结肠炎模型[0089]葡聚糖硫酸钠DSS是最常用的溃疡性结肠炎UC的模型。在该模型中，DSS是添加到饮用水中诱导模拟UC的急性疾病的化学刺激物。DSS结肠炎的急性期表征为嗜中性粒细胞招募到粘膜和粘膜下并增加ELR+CXC趋化因子的表达。但是，对DSS的慢性暴露导致严重的肠道损伤和显著的体重丧失，其在结肠炎模型中是不合适的。为了适应此模型的急性性质，以预防性的方式使用抗体1来测试其抑制嗜中性粒细胞招募和发展结肠炎的能力。在此模型中值得注意的是，小鼠CXCL5LIX蛋白在结肠组织中显著增加Kwon2005;但是抗体1不中和此小鼠细胞因子。[0090]获得了C57BL6小鼠，8-10周龄，重18-22g。通过心脏穿刺收集血液并分析以建立基线。为了诱导结肠炎，小鼠在饮用水中接受2.5%DSSMW=36，000-50，000进行5天第1-5天），随后是6天的无DSS水反映急性炎症）。对照健康小鼠仅接受水（“无DSS”组）。在第0、2、4和8天，接受DSS的小鼠用人IgG4对照抗体25mgkg或抗体125mgkg通过皮下注射给药。每天记录体重。对于每种治疗使用的小鼠的数目是9除了在健康的“无DSS”组中使用5只健康小鼠之外）。一式四份进行该研究。[0091]如表6所示，接受人IgG4对照抗体的DSS小鼠在第5天和第8天之间显著丧失体重。在诱导结肠炎之前和疾病的急性期期间接受抗体1的DSS小鼠显示在第5天和第8天之间相比那些用人IgG4对照抗体治疗的DSS小鼠更少的体重丧失在第8天，对于抗体1为94.0%的初始体重相比对于IgG4对照为85.3%的初始体重）。这些结果证明，抗体1的全身施用有效缓解DSS诱导的结肠炎中的体重丧失，支持如下结论，即抗体1中和某些小鼠ELR+CXC趋化因子的活性并降低结肠的嗜中性粒细胞的招募。[0092]表6[0093][0094]在786-0M明细胞肾细胞异种移植物模型中的体内中和作用[0095]786-0肾细胞癌RCC细胞与matrigell:1混合并皮下植入到无胸腺的雌性裸鼠右后侧，以每次注射3.0XIO6细胞。具有达到100mm3肿瘤体积的786-0异种移植物负荷小鼠在连续给药方案下喂饲10mgkg舒尼替尼，每天两次，直至即使在舒尼替尼治疗下的小鼠也像对照治疗小鼠（IgG4和10%媒介物一样开始发展肿瘤生长。舒尼替尼治疗下发展肿瘤生长的小鼠随机分入2组。一组接受10mgkg舒尼替尼，每天两次加20mgkg的对照IgG4抗体，每周一次。另一组接受10mgkg舒尼替尼，每天两次加20mgkg的抗体1，每周一次。平均肿瘤体积标准偏差在括号中）显示在表7中。将抗体1添加到舒尼替尼随时间显著减少肿瘤生长p〈0.0001，指示抗体1使透明细胞RCC肿瘤对舒尼替尼治疗重新敏感。[0096]表7[0097][0098]在SK0V3-Luc卵巢癌异种移植物模型中的体内中和作用[0099]SK0V3-LUC是表达萤火虫荧光素酶基因的人卵巢癌细胞系。SK0V3-LUC细胞经常用于体内以建立人卵巢腺癌肿瘤生长。[0100]SK0V3-Luc卵巢癌细胞与matrigell:1混合并皮下植入到无胸腺的雌性裸鼠右后侦L以每次注射3.0XIO6细胞。当异种移植物生长到200mm3平均肿瘤体积后，在基线时根据肿瘤体积将小鼠随机分到4组中。通过腹膜内注射，使小鼠接受对照IgG4抗体2.5mgkg，每周一次）、顺钼（2.5mgkg，每周一次）、抗体120mgkg，每周一次或顺钼（2.5mgkg，每周一次和抗体120mgkg，每周一次）的组合。肿瘤生长显示在表8中。相比同种型对照，顺铂单一治疗没有显示统计学显著性的肿瘤生长抑制。但是，相比同种型对照和顺铂单一治疗，顺铂和抗体1的组合显示统计学显著性的肿瘤生长抑制P〇.001，指示在SK0V3-Luc卵巢癌异种移植物模型中，抗体1协同增强化疗。[0101]表8[0102][0103]jy^lj[0104]抗体I重链氨基酸序列：SEQIDNO:I[0105][0106]抗体1重链可变区：SEQIDNO:2[0107][0108]抗体1轻链氨基酸序列：SEQIDNO:3[0109][0110]抗体1轻链可变区：SEQIDNO:4[0111][0112]抗体1重链DNA序列：SEQIDNO:5[0115]抗体1轻链DNA序列：SEQIDNO:6[0116][0117]抗体1抗体2LCDRl:SEQIDNO:7[0118]HXSQsiSW5KH[0119]抗体1抗体2LCDR2:SEQIDNO:8[0120]:侧涵餐[0121]抗体1抗体2LCDR3:SEQIDNO:9[0122]iiQNNi.WPHV[0123]抗体I抗体2HCDRl:SEQIDNO:10[0124][0125]抗体I抗体2HCDR2:SEQIDNO:11[0126]NlM1NSiiSANYNiKVKN[0127]抗体IHCDR3:SEQIDNO:12[0128]Ηί；Γ\NYYl^Kb-VYnsui[0129]抗体2重链氨基酸序列：SEQIDNO:13[0130][0131]抗体2重链可变区：SEQIDNO:14[0132][0133]抗体2轻链氨基酸序列：SEQIDNO:15[0134][0135]抗体2轻链可变区：SEQIDNO:16[0136][0137]抗体2重链DNA序列：SEQIDNO:17[0138][0139][0140]抗体2轻链DNA序列：SEQIDNO:18[0141][0142]抗体2HCDR3:SEQIDNO:19[0143]1岑較翁IfY[0144]HCDR3共有序列：SEQIDNO:20[0145]繼續_漏办趟麵L:[0146]其中Xaa是E或Q[0147]人Gro-aCXCLl:SEQIDN0:21[0148][0149]人Gr〇-0CXCL2:SEQIDN0:22[0150][0151]人Gro-γCXCL3:SEQIDN0:23[0152][0153]人ENA-78CXCL5:SEQIDNO:24[0154][0155]人GCP-2CXCL6:SEQIDNO:25[0156][0157]人NAP-2CXCL7:SEQIDNO:26[0158][0159]人IL-8CXCL8:SEQIDNO:27[0160]

权利要求：I·结合人Gro-α、Gro-β、Gro-γ、ENA-78、GCP-2、NAP-2和IL-8的抗体，所述抗体包含轻链和重链，其中所述轻链包含轻链可变区（LCVR并且所述重链包含重链可变区（HCVR，其中所述LCVR包括LCDRl、LCDR2、LCDR3并且所述HCVR包括HCDRl、HCDR2、HCDR3，其中LCDRl是RASQSISNNLHSEQIDN0:7，LCDR2是YTSRSVSSEQIDN0:8，LCDR3是GQNNEWPEVSEQIDN0:9，HCDR1是GYEFTSYWIHSEQIDN0:10，HCDR2是NISPNSGSANYNEKFKSSEQIDN0:11，并且HCDR3是EGPYSYYPSRXaaYYGSDLSEQIDNO:20，其中Xaa是E或Q。2.权利要求I的抗体，其中所述HCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:2或SEQIDNO:14。3.权利要求1的抗体，其中所述LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:4或SEQIDNO:16。4.权利要求1的抗体，其中所述HCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:2并且所述LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:4。5.权利要求1的抗体，其中所述重链的氨基酸序列是SEQIDNO:1并且所述轻链的氨基酸序列是SEQIDNO:3。6.权利要求1的抗体，其中所述抗体包含两条具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的重链和两条具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的轻链。7.DNA分子，其包含编码具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:13的氨基酸序列的多肽的第一多核苷酸序列；和包含编码具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:15的氨基酸序列的多肽的第二多核苷酸序列。8.包含权利要求7的DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述细胞能够表达权利要求1-6任一项的抗体。9.生产根据权利要求1-6任一项的抗体的方法，所述方法包括在使得所述抗体表达的条件下培养权利要求8的哺乳动物细胞并回收表达的抗体。10.通过权利要求9的方法生产的抗体。11.根据权利要求1-6和10任一项的抗体在制备用于治疗患者中溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的药物中的用途。12.根据权利要求1-6和10任一项的抗体，其用于治疗。13.根据权利要求1-6和10任一项的抗体，其用于溃疡性结肠炎、肾癌或卵巢癌的治疗。

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