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龙图腾网恭喜华南师范大学申请的专利一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN114921529B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-05-23发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202210527142.8，技术领域涉及：C12Q1/6851；该发明授权一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用是由常好才;朱梦媛;欧阳雯雯设计研发完成，并于2022-05-16向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用在说明书摘要公布了：本发明公开一种利用TthAgo酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用。该方法包括如下步骤：1根据需要检测的目标基因或DNA序列设计2条识别突变端的gDNA和2条识别非突变端的gDNA，均为16～19nt；2利用设计的4条gDNA和TthAgo酶对目标基因或DNA片段进行剪切；3针对目标基因或DNA片段上TthAgo酶两端剪切位点之间的45～65bp序列设计恒温扩增的引物，并进行PCR恒温扩增；4根据恒温扩增反应过程中待测样品相对野生型样品的Ct值来判断待测样品中是否存在单碱基突变。本发明方法步骤简便，操作简单，具有高特异性、高灵敏性，可用于低丰度单碱基突变的检测。

本发明授权一种利用Tth Ago酶剪切检测基因单碱基突变的方法及其应用在权利要求书中公布了：1.一种非疾病诊断目的的利用TthAgo酶剪切检测基因单碱基突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）设计4条gDNA根据目标基因或DNA片段序列分别设计2条16～19nt的5’端第一个碱基均为T且被磷酸基团修饰的识别突变端和识别非突变端的gDNA；其中，识别突变端的gDNA除第一个碱基外，其余序列与目标基因的突变型基因序列互补，且与野生型目标基因或DNA片段的错配位点位于互补序列的第9、10、11或15位；识别非突变端的gDNA除第一个碱基外，其余序列与突变端gDNA剪切位点的上游或下游45～65bp处的序列互补；4条gDNA序列不同；（2）TthAgo酶剪切将TthAgo酶、步骤（1）中的识别突变端和识别非突变端的gDNA分别在含1～6mmolLMn2+的缓冲体系中孵育15～30分钟，然后将其混合并加入含目标基因或DNA片段的待测样品，在75℃~85℃下进行剪切反应，同时以含目标基因或DNA片段的野生型基因为对照样品，反应得到酶切产物；（3）荧光定量PCR①根据突变端和非突变端gDNA引导的TthAgo酶在目标基因或DNA片段上的两端剪切位点之间的45～65bpDNA片段序列设计一对长度为20～25nt、且满足从该DNA片段两端的顶端开始扩增的PCR恒温扩增引物；②将步骤（2）中的酶切产物先经核酸外切酶处理，然后分别加入到含有具有链置换活性的DNA聚合酶、体积百分比1～4%PEG200和0.9～1.8molL甜菜碱的反应体系中，利用步骤①中的PCR恒温扩增引物进行扩增，分别获取实时荧光曲线，以此判断待测样品中是否存在单碱基突变；（4）判断若对照样品的实时荧光曲线随着时间的变化一直趋于平稳或其Ct值低于待测样品的Ct值，且待测样品的实时荧光曲线随着时间的延长存在指数扩增的过程，说明该待测样品存在单碱基突变；若待测样品的实时荧光曲线随时间变化与对照样品一致，说明该待测样品不存在单碱基突变。

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