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龙图腾网恭喜浙江奥比特生物科技有限公司申请的专利一种高纯度经血来源干细胞的制备方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN106011052B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-03-28发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：201610422697.0，技术领域涉及：C12N5/074；该发明授权一种高纯度经血来源干细胞的制备方法是由葛剑云;汪土根;刘心星;黄启明设计研发完成，并于2016-06-15向国家知识产权局提交的专利申请。

本一种高纯度经血来源干细胞的制备方法在说明书摘要公布了：本发明提供一种高纯度经血来源干细胞的制备方法：使用经血采集套装收集经血；收集中间层单个核细胞；加入磁珠缓冲液，充分混匀后加入FcR试剂，孵育后再加入交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后孵育；再加入磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中；加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；将分选柱取出，加入1.5‑2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；将所得悬液用经血干细胞原代培养基培养，每2‑3天半量换液一次；培养5‑7天后消化收集贴壁细胞，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；消化所得细胞，加入冻存液进行冻存。该方法获得的经血来源干细胞纯度高，生长周期短，自我更新能力强、污染率低。

本发明授权一种高纯度经血来源干细胞的制备方法在权利要求书中公布了：1.一种高纯度经血来源干细胞的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：1使用经血采集套装，将经血收集到含抗生素保存液的经血采集管中，抗生素保存液与经血的混合比例为1-1.5：1，2-8℃下低温保存，保存期≤72小时；2将经血采集管离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；3将细胞沉淀与生理盐水按1：1-1.5的体积比充分混合后，缓慢加入到等体积的淋巴分离液界面上，离心，收集中间层单个核细胞，然后生理盐水洗涤、离心；4将获得的单个核细胞取样计细胞数，每1×108细胞：加入100-200μl磁珠缓冲液，充分混匀后加入50-100μlFcR试剂，2-8℃孵育5-10分钟后再加入50-100μl交联抗人抗体的微磁珠试剂，混匀后在2-8℃孵育10-20分钟；所述抗人抗体为抗人CD117单克隆抗体；所述微磁珠试剂为：MiltenyiBiotec产品，其货号130-091-332，粒径50nm；5步骤4所得液体再加入1-1.5ml的磁珠缓冲液，洗涤、离心后重悬于磁珠缓冲液中，细胞悬液的浓度为1×108细胞ml；6将上述细胞悬液全部加入到预先放置于磁性分选架的分选柱中，使用磁珠缓冲液冲柱洗涤；7将分选柱取出分选架，放置于无菌收集管中，加入1.5-2ml磁珠缓冲液，收集细胞悬液；8将所得悬液取样计细胞数，用经血干细胞原代培养基稀释后按5000-7000细胞cm2的密度接种到细胞培养瓶中，放置于37℃、5％CO2培养箱培养，每2-3天半量换液一次；9细胞培养至5-7天后，倒置显微镜下观察细胞已达到70-80％密度，消化收集贴壁细胞，按3000-5000细胞cm2的密度接种到细胞培养瓶，用经血干细胞传代培养基继续扩增培养；10将消化所得的细胞混合于2-8℃预冷的经血干细胞冻存液中，并加入到冻存管中，细胞密度为0.1-1×107细胞ml，放入冻存盒，于-80℃冰箱放置12-24小时后转入-196℃液氮冻存；所述步骤1中抗生素保存液以HBSS为基液，含肝素钠420单位、头孢氨苄250μgmL、庆大霉素120μgmL、两性霉素B3μgmL；所述磁珠缓冲液的具体配方为：以磷酸缓冲盐溶液为基液，含体积百分比为0.5％的胎牛血清或牛血清白蛋白或人血清白蛋白，含终浓度为2mM的乙二胺四乙酸；所述步骤8中经血干细胞原代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为40％的ChangAmnio培养基，体积百分比为29％的UltraCULTURE培养基，体积百分比为1％的青链双抗；所述步骤9中经血干细胞传代培养基：含体积百分比为30％的α-MEM培养基，体积百分比为35％的ChangAmnio培养基，体积百分比为35％的UltraCULTURE培养基，浓度为10-20ngml的EGF，浓度为10-20ngml的bFGF；所述步骤10中经血干细胞冻存液：含体积百分比为32-40％的细胞培养液上清，体积百分比为8-10％的二甲基亚砜，体积百分比为25-30％的ChangAmnio培养基，体积百分比为25-30％的UltraCULTURE培养基。

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