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摘要：本发明涉及植物分子细胞生物学技术领域，尤其涉及一种高效分离分选荔枝组织的细胞核的方法。本发明先利用尺寸标准磁珠在显微镜上定出荔枝组织的细胞核的准确大小，然后使用流式细胞仪分选细胞核，再通过流式细胞仪尺寸标准磁珠限定细胞核的准确分选范围，最后通过细胞核荧光信号分选出高纯度高质量的细胞核。使用本发明可以快速分离出高纯度，且满足单细胞建库与测序的高质量细胞核，对于植物分子生物学和细胞生物学研究具有重大意义。

主权项：1.一种高效分离分选荔枝细胞核的方法，其特征在于，包括以下步骤：1将经过高温灭菌处理的研钵和杵置于冰上，向研钵中加入1mL细胞核提取液，然后将100mg荔枝叶片放入含有细胞核提取液的研钵中，在细胞核提取液中将荔枝叶片研磨破碎，充分释放出细胞核，并得到裂解后的荔枝叶片匀浆；2将步骤1裂解后的荔枝叶片匀浆转移到2mL无酶离心管中，使用1mL的细胞核提取液润洗步骤1中的研钵，将洗涤液与匀浆合并到所述2mL无酶离心管中以获得全部的细胞核悬液，然后将离心管置于混匀仪中摇晃15min，再使用40μm细胞筛对全部的细胞核悬液进行过滤处理，收集滤液并进行离心，离心条件为4℃下，1000g，5min，弃去上清液得沉淀物；3用1mL细胞核提取液润洗步骤2得到的沉淀物，并在4℃，1000g下，离心5min，弃去上清液收集沉淀物，并继续用1mL细胞核提取液润洗所收集的沉淀物，再次在4℃，1000g下，离心5min，弃去上清液收集沉淀物，得到细胞核沉淀，然后用1mLWS洗涤缓冲液重悬所述细胞核沉淀，将重悬液用流式管上的蓝色35μm细胞筛过滤，收集滤液；4向步骤3收集的滤液中加入3倍体积以上的1×DAPI细胞核染料溶液，冰上避光静置染色5min，然后在4℃条件下进行1000g离心5min，弃去上清液收集沉淀物；5用WS洗涤缓冲液洗涤步骤4得到的沉淀，两次，在4℃下进行1000g离心5min，最后用WS洗涤缓冲液重悬细胞核，并在荧光显微镜的明场和DAPI通道下观察细胞核。6在步骤5观察时，根据细胞核的大小选择两种流式细胞仪尺寸标准磁珠，磁珠涵盖细胞核的大小范围；7选择2.0-2.4μm磁珠设为左临界尺寸标准磁珠，将2.0-2.4μm尺寸标准磁珠涡旋30s，挤一滴进流式管中，加入500mLPBS缓冲液，涡旋30s，在流式细胞仪上样，然后调节前向散射光信号FSC-A和侧向散射光信号SSC-A电压，直至微粒位于FSC-A×SSC-A图像左角落，采集样品并收集数据；8选择3.1-3.5m磁珠设为右临界尺寸标准磁珠，将3.1-3.5m尺寸标准磁珠涡旋30s，挤一滴进流式管中，加入500mLPBS缓冲液，涡旋30s，在流式细胞仪上样，与7保持相同的电压分析条件，采集样品并收集数据；9根据调节好的电压，通过观察左、右临界尺寸标准磁珠的分布位置，在FSC-A×SSC-A图像上圈出细胞核大小位置的门，然后分别上样待分析的DAPI染色与未染色的细胞核样品，然后基于圈门位置的细胞核，选择DAPI激光条件分选回收阳性信号的细胞核；10将步骤9分选得到的细胞核结合尺寸标准磁珠进行荧光显微镜镜检。

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百度查询： 海南省农业科学院热带果树研究所 一种高效分离分选荔枝组织的细胞核的方法