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申请/专利权人：施维雅(青岛)生物制药有限公司;元贞健康产业(青岛)有限公司

摘要：一种利用海洋短梗霉制备含尿石素添加剂的方法及应用，属于海洋微生物应用技术领域，其主要步骤包括制备培养基；利用海洋短梗霉对石榴叶或和石榴皮进行发酵，制备鞣花酸；利用凝结魏茨曼氏菌和瑞士乳杆菌对鞣花酸进行二次发酵，获得含尿石素的发酵产物等。本发明产物中鞣花酸含量不低于0.8gL，尿石素的含量不低于0.15gL。本发明的产物可以进一步制备成食物补充剂、饲料添加剂或尿石素的纯化。

主权项：1.一种利用海洋短梗霉及复合微生物生产含尿石素添加剂的方法，包括如下步骤：（1）干燥的石榴叶或和石榴皮打粉，过80目细筛后，按任意比例混合，得混合粉，以下称混合粉；（2）混合粉以干重计，与纯净水按照重量比1：4混合均匀后，于发酵罐内，40-60℃浸泡1-2小时，得到浸泡液；（3）在步骤（2）浸泡液中加入如下重量百分比的营养物质：葡萄糖1-5%，蛋白胨0.1-3%，酵母粉1-5%，加入纯净海水至100%，混合均匀后，在115℃灭菌30min，降至室温，得海洋短梗霉培养基；（4）向步骤（3）海洋短梗霉培养基中接种海洋短梗霉，接种量：1-5×108CFUml，所述海洋短梗霉购买自自然资源部第三海洋研究所，海洋微生物菌种保存管理中心海洋菌种分库，菌种编号2E00823；（5）接种后，通入无菌空气，于20-40℃，恒温，搅拌培养36-48小时；（6）发酵过程中，检测鞣花酸含量达到0.8-1.5gL时，向发酵罐中加入纯酒精，直到酒精浓度达到60%（VV），减压至0.01MPa，加热至50-80℃，回流提取6小时，得提取液；（7）将上述提取液进行过滤后，回收酒精，并浓缩至原体积的10%，得浓缩液；（8）上述浓缩液中，加入步骤（3）的培养基，加入量是：培养基与浓缩液质量比为5：1，其中步骤（3）培养基含：每1kg培养基含：葡萄糖1-3wt%，氯化钙0.1-0.5wt%，大豆蛋白胨1-5wt%，酵母提取物0.1-1wt%，其余为纯净水，pH5-7，搅拌混合均匀后，115℃灭菌30min，冷却备用；（9）凝结魏茨曼氏菌和瑞士乳杆菌分别在菌种子液在步骤（2）中培养，按照细菌浓度1：1配制呈复合菌液，以下称复合菌；其中，魏茨曼氏菌购自美国ATCC公司，菌株编号7050；瑞士乳杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号1.1877；（10）前述复合菌接种到已灭菌第二步发酵培养基中，接种量：1-5×106CFUml；（11）接种后，通入无菌空气，于35-45℃，恒温，搅拌培养36-48小时；（12）所述发酵过程中，用高效液相色谱法检测尿石素，以尿石素A计，含量达到0.15-0.24gL时，发酵液降温至2-4℃，保持60分钟；（13）上述发酵液直接进行喷粉或低温干燥，制备成含有尿石素和混合菌芽孢的粉剂，用于饲料的添加剂，或用于尿石素的提取和纯化。

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