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申请/专利权人：中南大学

摘要：本发明涉及生物医药技术领域，公开了柚皮苷作为GIMAP7激动剂在RSV感染中的治疗方法，其方法包括以下步骤：S1：虚拟筛选与分子对接，S2：细胞培养与RSV感染，S3：Westernblot检测小分子化合物对GIMAP7表达的影响，S4：CCK8检测化合物对Beas‑2b和PC9细胞毒性，S5：RT‑qPCR检测RSV受体GIMAP7的表达以及RSV病毒载量，S6：间接免疫荧光检测RSV的荧光信号，S7：动物模型，S8：HE染色，S9：酶联免疫吸附试验ELISA，S10：统计学分析。本发明的免疫相关蛋白GTPase7GIMAP7通过与LC3B的直接相互作用调控自噬向凋亡转化而发挥抗RSV的作用，且通过分子对接筛选到的小分子化合物柚皮苷能激活GIMAP7的表达进而有效抑制RSV感染的小鼠模型肺部组中RSV病毒复制，并缓解肺部病理状态。因此柚皮苷是针对靶点GIMAP7治疗RSV感染的有效药物。

主权项：1.柚皮苷作为GIMAP7激动剂在RSV感染中的治疗方法，其特征在于：其方法包括以下步骤：S1：虚拟筛选与分子对接1虚拟筛选与分子对接GIMAP7晶体结构下载自RCSBPDB数据库，然后通过Autodockvinatool以及Pymol工具进行GIMAP7晶体结构检查，利用Targetmol公司提供的天然产物库中的4320种作为筛选与GIMAP7蛋白结合的化合物。使用的软件包括AutoDockTools1.5.6，OpenBabel3.1.1，以及可视化软件PyMOL。AutoDockTools1.5.6和PyMOL软件用于除水与加氢蛋白受体和小分子配体准备操作，高通量分子对接由AutodockVina进行，我们通过计算机对小分子数据库进行两步筛选。2分子动力学模拟分析配合物相互作用的结构稳定性对了解其结合亲和力至关重要，在本发明中，我们在LinuxCentos7操作系统上使用GROMACS2019.6软件进行分子动力学模拟，所有数据由Originlab处理；S2：细胞培养与RSV感染人正常肺上皮细胞系Beas-2b、PC9和Hela由中南大学基础医学院微生物系所冻存和保留，在无菌条件下培养细胞，并在含有10％胎牛血清的DMEM和1640培养基37℃培养箱，5％CO2中培养，RSVLongstrainA2typewasstoredbytheDepartmentofMedicalMicrobiologyofCentralSouthUniversity；S3：Westernblot检测小分子化合物对GIMAP7表达的影响取细胞生长状态良好的Beas-2b细胞铺于六孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的小分子化合物柚皮苷0mM、0.5mM、1mM和2mM,分别作用24h后，提取细胞总蛋白后进行蛋白电泳GIMAP7含量检测；S4：CCK8检测化合物对Beas-2b和PC9细胞毒性细胞毒性试验采用CellCountingKit-8检测，Beas-2b在96孔细胞培养板的密度2×103个细胞，加入不同浓度的Narirutin0mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM和5mM；S5：RT-qPCR检测RSV、GIMAP7的表达以及RSV病毒载量建立小分子化合物细胞组和DMSO对照组，从Hela的Beas-2b细胞中制备总RNA，并用SmartSpecTMPlus分光光度计Bio-rad,USA进行定量，使用Trizol试剂从肺组织中提取总RNA，使用RR036APrimeScriptRTMasterMix将每个样本逆转录为cDNA，按照说明书使用2×SYBRGreenqPCRMasterMix进行扩增；S6：间接免疫荧光检测RSV的荧光信号4％多聚甲醛固定和0.4％Triton-X100通透Beas-2b细胞，肺组织切片在95％乙醇和0.1％triton-X100中通透，用正常山羊血清封闭20分钟，加入RSV主要表面糖蛋白G单克隆抗体兔一抗4℃孵育过夜，第二天，用PBST洗切片3次，每次4min，滴加稀释的山羊抗兔IgGCY3二抗，37℃孵育1h，再PBST浸洗3次，每次4min，滴加DAPI后避光孵育5min复染核，最后PBST清洗切片5次，每次4min后封片共聚焦激光扫描显微镜下对样品进行拍照观察；S7：动物模型准备24只4-6周龄、雌性、BALBc小鼠，经随机方式归入至健康对照组、RSV感染组、GIMAP7筛选药物干预组：柚皮苷10mgkg、柚皮苷40mgkg，各组实验动物皆先于标准条件下适应5-7d；异氟醚麻醉小鼠后，鼻内接种RSV5×106pfu100μL；S8：HE染色每只动物的肺组织在10％甲醛溶液中固定24小时，然后石蜡包埋，切成5μm薄片，按照常规实验程序进行苏木精-伊红染色，并在光学显微镜下观察组织形态学变化；S9：酶联免疫吸附试验ELISA收集小鼠肺匀浆，使用ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6和TNF-α水平，小鼠肺匀浆4℃1000rpm离心10min，收集上清液，使用TECANF50在450nm处测量OD值；S10：统计学分析借助Excel，开展原始计数资料的整合与分析工作，Graphpad8.0被用于作图和分析，使用Wilcoxon秩和检验或Student'st检验比较组间差异，所有实验重复三次以上，当p值在0.05以下时判定差异显著，具统计学价值。

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