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申请/专利权人：广东省农业科学院蔬菜研究所;广东省农业科学院农业生物基因研究中心

摘要：本发明属于作物基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPRCas9介导的冬瓜基因编辑方法。本发明首先设计冬瓜目的基因的靶位点，并将其构建到CRISPRCas9介导的基因编辑载体pGH‑rGRF‑GIF‑CR中，得到目的基因‑pGH‑rGRF‑GIF‑CR重组载体后将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，然后通过侵染、共培养、再生等步骤转化冬瓜外植体；最后筛选阳性芽即得到转化成功的冬瓜再生芽。本发明通过构建CRISPRCas9介导的冬瓜基因编辑载体，并利用农杆菌介导的转基因，从而实现对目的基因的编辑，为后续通过基因编辑研究目的基因的功能，以及加快培育冬瓜新品种提供途径。

主权项：1.一种CRISPRCas9介导的冬瓜基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、设计目的基因的靶位点，再克隆目的基因靶位点片段并进行回收，然后将回收的目的基因靶位点片段与经酶切的pGH-rGRF-GIF-CR载体连接；S2、将S1的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR鉴定后测序，对测序正确的菌落进行扩大培养，并提取质粒，得到目的基因-pGH-rGRF-GIF-CR重组载体；S3、将S2的目的基因-pGH-rGRF-GIF-CR重组载体转化农杆菌感受态细胞，经含利福平和硫酸卡那霉素的培养基抗性筛选后得到含重组载体的农杆菌，将含重组载体的农杆菌培养至OD600＝0.6–0.8，并用侵染培养基重悬至OD600＝0.2–0.3作为侵染液；所述侵染培养基包括4-5gLMS培养基、25-35gL蔗糖和180-220μM乙酰丁香酮；S4、将饱满的冬瓜种子于45-55℃温汤中浸种25-35min，再室温浸泡后剥去种壳，用低浓度NaClO溶液摇动浸泡5-10min，消毒后将种子播种于种子培养基上，避光培养至发芽后，切除子叶上部，并将子叶横切成两半，去除生长点及下胚轴，以子叶近端U形末端作为外植体；所述种子培养基包括4-5gLMS培养基、25-35gL蔗糖和2-3gL植物凝胶；S5、通过真空负压法以S3的侵染液对S4的外植体进行侵染，然后将处理好的外植体转移至共培养培养基上，在25℃条件下避光培养3-5d；所述共培养培养基包括4-5gLMS培养基、25-35gL蔗糖、2-3gL植物凝胶、180-220μM乙酰丁香酮、0.4-0.6mgL6-苄氨基嘌呤和1-2mgL脱落酸；S6、将共培养后的外植体转移至芽再生培养基上，在25℃，16h光照8h黑暗条件下生长4–6周，待不定芽长出后，筛选阳性芽，即得转化成功的再生芽；所述芽再生培养基包括4-5gLMS培养基、25-35gL蔗糖、2-3gL植物凝胶、0.4-0.6mgL6-苄氨基嘌呤、1-2mgL脱落酸和280-320mgL特美汀；S7、切下再生芽，转移至生根培养基中，再对根系发育良好的植株进行驯化，待植株长出新叶后，即可进行正常生长发育；所述生根培养基包括4-5gLMS培养基、25-35gL蔗糖、2-3gL植物凝胶、0.01-0.03mgL3-吲哚乙酸和280-320mgL特美汀。

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