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摘要：本发明提供了一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR‑Cas12检测方法及应用。CRISPR‑Cas12耐药基因突变检测体系的使用前提是在识别序列附近存在PAM序列，但部分耐药突变位点附近并不存在天然PAM序列，极大地限制CRISPR‑Cas12耐药基因突变检测体系的应用。本发明包括用于结核分枝杆菌耐药基因高效扩增的巢式PCR引物组、用于在指定位置插入PAM序列的巢式PCR引物组和sgRNA，可用于制备检测或辅助检测耐多药结核分枝杆菌的利福平耐药性试剂盒，方便进行包括结核分枝杆菌常见耐药基因，例如rpoB基因的耐药突变位点检测，降低检测成本，具有良好的应用前景。

主权项：1.一种用于天然PAM缺失结核分枝杆菌耐药突变的CRISPR-Cas12检测试剂盒，其包括：巢式PCR扩增体系和CRISPR-Cas12体系；其中，巢式PCR扩增体系包括巢式PCR引物组，其为用于结核分枝杆菌rpoB基因531526516突变位点附近PAM序列插入的引物组，所述引物组序列包括：TB-1F:CCGACGACATCGACCACTT（SEQIDNO：1）；TB-1R:GGTACGGCGTTTCGATGAAC（SEQIDNO：2）；TB-2F:ACGTGGAGGCGATCACA（SEQIDNO：3）；TB-2R:AGCCGATCAGACCGATGTT（SEQIDNO：4）；TB-probe:CAGAACAACCCGCTGTCGG（SEQIDNO：5）；531-PAM:GACCCACAAGCGCCGATTG（SEQIDNO：6）；526-PAM:CCCGCTGTCGGGGTTGTTC（SEQIDNO：7）；和或516-PAM:CCAGCTGAGCCAATTCTTG（SEQIDNO：8）；其中，CRISPR-Cas12体系包括CRISPR-Cas12核酸酶和sgRNA，其中sgRNA-531序列选自：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCGGCGCUGGGGCCCGGCGGUCUG（SEQIDNO：9）；UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCGGCGCUGGGGCCCGGCGGUCU（SEQIDNO：10）；和或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCGGCGCUGGGGCCCGGCGGUC（SEQIDNO：11）；sgRNA-526序列选自：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACAAGCGCCGACUGUCGGCGCUG（SEQIDNO：12）；UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACAAGCGCCGACUGUCGGCGCU（SEQIDNO：13）；和或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACAAGCGCCGACUGUCGGCGC（SEQIDNO：14）；sgRNA-516序列选自：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGACCAGAACAACCCGCUGUCGGGG（SEQIDNO：15）；UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGACCAGAACAACCCGCUGUCGGG（SEQIDNO：16）；和或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGACCAGAACAACCCGCUGUCGG（SEQIDNO：17）。

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百度查询： 温州医科大学附属第一医院 天然PAM缺失结核分枝杆菌耐药突变的CRISPR-Cas12检测方法及应用