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申请/专利权人：中国农业大学三亚研究院

摘要：本发明公开了一种Zophobasatratus防御素高效信号肽筛选菌株的构建方法，属于生物技术领域。本发明采用的步骤如下：（一）重组表达载体的构建；（二）构建基因工程菌；（三）诱导表达和产物鉴定。本发明通过构建Zophobasatratus防御素高效信号肽菌株，通过原核表达技术获得天然抗菌肽，克服了生产成本高，在本体动物中提取产量低的问题，并使其成为畜牧养殖中抗生素有效替代品。本发明筛选了表达宿主枯草芽孢杆菌五种信号肽，并提高其产量，同时验证了目标蛋白对多种多重耐药致病菌的抑制活性。

主权项：1.一种表达Zophobasatratus防御素和信号肽融合基因的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：一重组表达载体的构建；二构建基因工程菌；三诱导表达和产物鉴定；步骤一重组表达载体的构建，具体步骤如下：1五种信号肽基因PCR扩增：五种信号肽基因为SPbpr、SPdacB、SPeapD、SPlytE、SPwapA，其核苷酸序列如SEQIDNO:1-5所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:6-10所示；2抗菌肽基因的合成以及克隆载体的构建：抗菌肽基因为Zophobasatratus防御素，其核苷酸序列如SEQIDNO:12所示，其氨基酸序列如SEQIDNO:11所示；抗菌肽基因使用RACE-PCR扩增，确定核苷酸序列，核苷酸序列5’端和3’端同时带有BamhI酶切位点，并连接至克隆载体PUC57，形成重组载体PUC57-ZD；抗菌肽基因的氨基酸序列N端带有6个HIS标签；通过PCR反应体系扩增信号肽基因序列，并进行切胶回收：通过PCR反应体系扩增抗菌肽基因序列，并进行切胶回收：3表达载体提取与酶切：将含有表达载体PMA5的大肠杆菌接种5ml含有100μgmL氨苄西林的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，提取质粒，将提取的质粒进行单酶切，用于后续同源重组；4Zophobasatratus防御素和信号肽融合基因连接至表达载体：通过同源重组技术将Zophobasatratus防御素和信号肽融合基因连接至线性化表达载体PMA5，得到重组载体PMA5-SPn-ZD，连接反应体系如下：线性化载体，160ng；目的基因，20ng；同源重组酶，5μl；ddH2O，补齐至10μl；同源重组反应条件为50℃，5min，将连接产物转化至克隆载体DH5α，随后涂布于含有100μgml氨苄西林抗性的LB琼脂平板，过夜培养，挑取单克隆菌落用于菌液PCR、酶切和测序验证，Zophobasatratus防御素和信号肽融合基因的测序结果如SEQIDNO:13-17所示；步骤二构建基因工程菌的具体步骤如下：1挑取宿主菌WB600的单菌落接种至2mlSP-I培养基中，置于50ml离心管，37℃、200rpm过夜培养；2取过夜培养菌液100μl接种至5mlSP-I培养基，37℃、200rpm培养至菌液OD600在0.6-0.8之间；3取200μl步骤2中菌液接种至2mlSP-Ⅱ培养基，37℃、100rpm培养90min；4加入20μl100×EGTA溶液，继续培养10min，然后500μl分装，置于1.5ml离心管；5每管中加入1μg重组质粒PMA5、PMA5-SPn-ZD，37℃，100rpm，30min后调整转速至200rpm，继续培养2.5h；6将菌液8000g，5min离心后弃去400μl上清，剩余上清重悬菌体，用涂布棒涂布至含50μgml卡那霉素的LB琼脂平板，过夜培养；7重组菌株PCR鉴定：挑取上述基因工程菌单个菌落接种至800μl含25μgml氯霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养8h，随后进行菌液PCR验证，获得重组菌株WB600-PMA5、WB600-PMA5-SPn-ZD；步骤三诱导表达和产物鉴定的具体步骤如下：1分别挑取重组菌株WB600-PMA5，WB600-PMA5-SPn-ZD单个菌落接种至5ml含50μgml卡那霉素的LB液体培养基37℃，200rpm过夜培养，所得菌液作为发酵种子液；2吸取25μl种子液接种至25ml含50μgml卡那霉素的2×SR液体培养基，37℃，180rpm摇床培养24h；38000g，5min离心收集上清，用于表达产物鉴定；4取1.35ml菌液上清，添加150μl100％三氯乙酸混匀，4℃过夜沉淀蛋白；515000g，15min，4℃离心步骤4所述产物，弃去上清，收集沉淀；6使用预冷的丙酮重悬洗涤5中所得沉淀，15000g，15min，4℃离心，弃去上清，通风干燥至丙酮完全挥发；7在步骤6中所得沉淀加入40μl1×Tricine上样缓冲液，沸水水浴10min，所得产物用于Tris-tricine电泳和考马斯亮兰染色；其中，步骤一重组表达载体的构建中，扩增信号肽基因所用的引物序列如下：bpr-F：5’-aaagtgaaatcagggggatccATGAGGAAAAAAACGAAAAACAGAC-3’bPR-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’dacB-F：5’-aaagtgaaatcagggggatccATGCGCATTTTCAAAAAAGCA-3’dacB-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’eapD-F：5’-aaagtgaaatcagggggatccATGAAAAAGCTTTTGACTGTCATGA-3’eapD-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’lytE-F：5’-aaagtgaaatcagggggatccATGAAAAAGCAAATCATTACAGCTACG-3’lyte-R：5’tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’wapA-F：5’-aaagtgaaatcagggggatccATGAAAAAAAGAAAGAGGCGAAAC-3’wapA-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’；其中，步骤一重组表达载体的构建中，扩增抗菌肽基因所用的引物序列如下：bpr-BamhI-ZD-F：5’-aCACCACCATCACCACCACTTC-3’bpr-BamhI-ZD-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’dacB-BamhI-ZD-F：5’-atacagcacatgctCACCACCATCACCACCACTT-3’dacB-BamhI-ZD-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’eapD-BamhI-ZD-F：5’-gcacagagtCACCACCATCACCACCACTTC-3’eapD-BamhI-ZD-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’lytE-BamhI-ZD-F：5’-gcatctgcaCACCACCATCACCACCACTTC-3’lytE-BamhI-ZD-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’wapA-BamhI-ZD-F：5’-tttcattagtgccagccCACCACCATCACCACCACTTC-3’wapA-BamhI-ZD-R：5’-tctggtacgtaccaagctagcTTAACGGCAAACGCATACAGAT-3’。

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百度查询： 中国农业大学三亚研究院 Zophobas atratus防御素高效信号肽筛选菌株的制备方法和应用