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申请/专利权人：华中农业大学

摘要：本发明公开了一种利用Ω‑FISH检测循环肿瘤细胞中AR‑V7剪接变体表达情况的方法，该方法首先设计出含有特异性靶向序列的两条RCA引发探针和两个半圆环式探针，再在体外将两个半圆环式探针磷酸化后将两条RCA引发探针退火处理后形成预制探针，并设计出次级杂交探针且次级杂交探针与初级杂交探针中的部分区域互补配对，使用预制探针与次级杂交探针对待检样品进行荧光杂交，最后通过对荧光信号的解读，确定CTC中AR‑V7的表达情况，本发明可达到快速精准检测AR‑V7剪接变体表达情况的目的，检测信号强度高、特异性好；其降低检测成本和检测操作难度、提高了检测灵敏度，推动了原位空间转录组在CTC研究中的发展及临床应用。

主权项：1.一种利用Ω-FISH检测循环肿瘤细胞中AR-V7剪接变体表达情况的方法，其特征在于：包括以下步骤：1初级杂交探针的设计从待检测细胞或组织的核酸序列中筛选出杂交效率高、特异性强、无RNA高级结构的靶序列，并将设计出初级杂交探针，其中，所述初级杂交探针由两条半圆环探针和两条RCA引发探针组成；2次级杂交探针的设计根据待检测细胞或组织的核酸种类数，设计1条次级杂交探针，所述次级杂交探针与初级杂交探针中的部分区域互补连接；3初级杂交探针预处理对初级杂交探针中两个半圆环探针的5’端进行磷酸化处理，随后与两条RCA引发探针退火结合，构成初级杂交探针；4初级探针杂交在待检测的循环肿瘤样本片上制备一个反应腔室，依次进行固定、脱水和透化处理，再将含有初级杂交探针的溶液加入到反应腔室中进行杂交反应；5连接反应加入连接酶反应体系，进行连接反应，使两个半圆环探针形成闭合的环状结构；6滚环扩增使用Phi29DNA聚合酶以两条RCA引发探针为引物，以探针的环状结构为模板进行滚环扩增，形成大量重复的核酸序列供次级杂交探针结合；7次级杂交探针杂交次级探针的杂交使用1种带有荧光标记的次级杂交探针与杂交缓冲液混合后加入反应腔室中进行杂交反应，进行下一轮杂交前使用洗涤液洗去组织中前一轮的次级杂交探针；8信号解读在杂交结束后对待测样本进行成像以检测次级杂交探针所携带的标记，通过杂交和成像，每一个信号点代表一个检测到的核酸，进而确定核酸分子的表达情况。

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权利要求：

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