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申请/专利权人：中普生物科技(天津)有限公司

摘要：本发明涉及一种抗TNFα卵黄抗体的制备方法。本发明利用大肠杆菌系统可溶性表达TNFα蛋白，将SUMO基因与TNFα截短基因序列融合，基因片段构建到大肠杆菌表达载体中，转化感受态细胞，经IPTG诱导后表达蛋白，纯化过程中用ULP蛋白酶切割除去SUMO标签得到可溶性TNFα蛋白，并接种免疫得到免疫蛋鸡，利用免疫蛋鸡制备抗TNFα蛋白的卵黄抗体制剂。此方法简化操作，保证制得的抗体中的有效蛋白量，降低生产成本，提高卵黄抗体的特异性，为卵黄抗体制备的新方法。得到的抗TNFα卵黄抗体能以不同制剂形式用于缓解炎症发生和发展，本方法及制得的抗TNFα卵黄抗体具有广泛的应用前景。

主权项：1.一种抗TNFα卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：步骤一、将编码SUMO蛋白的基因与经密码子优化的TNFα截短基因融合，在TNFα截短基因序列的N端融合SUMO蛋白的基因，获得重组SUMO-TNFα基因片段；步骤二、利用同源重组法将重组SUMO-TNFα基因片段构建到PET28a载体上，构建得到重组质粒PET28a-SUMO-TNFα，将重组质粒PET28a-SUMO-TNFα转化BL21DE3感受态细胞，得到表达重组蛋白的菌株；步骤三、对菌株进行培养，然后使菌株在16℃-37℃加入0.5mMIPTG诱导4-16h后表达含有SUMO标签的TNFα蛋白，纯化含有SUMO标签的TNFα蛋白，将含有ULP-His蛋白酶的平衡缓冲液与Ni+填料混合，室温反应1-2h后用20mMTirs、300mMNaCl、400mM咪唑洗脱纯化的含有SUMO标签的TNFα蛋白，用ULP-His蛋白酶切除SUMO标签，按照每管1mLTNFα蛋白进行收集，获得TNFα可溶性重组蛋白；步骤四、将TNFα可溶性重组蛋白用0.22μM滤膜过滤，取50-200μgTNFα可溶性重组蛋白与佐剂按体积比为1-3：2-7混匀乳化成油包水形式TNFα抗原，每只蛋鸡胸下肌肉接种TNFα抗原，完成蛋鸡的免疫接种后收集免疫蛋鸡的鸡蛋，得到免疫蛋；步骤五、用酒精擦拭免疫蛋表面进行消毒，用蛋清分离器分离蛋黄，用滤纸去除蛋黄外残留的蛋清脂质，然后加入10倍体积的冷水将蛋黄进行稀释，并用盐酸溶液调节混合液pH为5.0，得到蛋黄稀释液，4℃静置过夜；步骤六、将静置过夜的蛋黄稀释液在4℃条件下10000rpmmin离心10min，将分离的上清液中加入40％-60％的饱和硫酸铵溶液，然后进行充分搅拌混匀，得到硫酸铵混合液，4℃静置过夜；步骤七、将静置过夜的硫酸铵混合液10000rpmmin离心15min，弃上清液，加入PBS溶液将卵黄抗体沉淀重悬，然后转移入透析袋中，4℃透析过夜，透析完成后，用0.22μm滤膜过滤，最终得到抗TNFα卵黄抗体，分装存放备用。

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