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申请/专利权人:武汉铂安诺生物科技有限公司
摘要:本发明涉及基因检测技术领域,特别涉及基于纳米孔技术筛查肥厚型心肌病致病基因的检测方法,具体操作包括以下步骤:S1、肥厚型心肌病HCM的检测范围panel设计:根据《中国成人HCM诊断与治疗指南2023》、《中国儿童HCM诊断的专家共识‑2019》,通过整理Clinvar数据库,确定HCM诊断相关基因为78个。本发明所述的基于纳米孔技术筛查肥厚型心肌病致病基因的检测方法,能够全方面的检测肥厚型心肌病的致病基因及其相关突变型别。同时相对于传统检测和二代mNGS检测技术,做到了超长读长测序、数据实时分析,简化了整个检测流程,提高检测效率,降低人力成本,最大化的提高数据的使用率,能够满足临床对于肥厚型心肌病基因筛查和诊断的需求。
主权项:1.基于纳米孔技术筛查肥厚型心肌病致病基因的检测方法,具体操作包括以下步骤:S1、肥厚型心肌病HCM的检测范围panel设计:根据《中国成人HCM诊断与治疗指南2023》、《中国儿童HCM诊断的专家共识-2019》,通过整理Clinvar数据库,确定HCM诊断相关基因为78个,具体基因名称如下表所示: 表1:肥厚型心肌病HCM基因检测名单S2、基因组核酸提取:选择血液样本进行检测,使用诺唯赞DM101试剂提取基因组。样本体积为200μl,加入2倍样本体积的BufferEL,颠倒混匀,10,000rpm11,500×g,1min,弃上清,添加50μlPBS,振荡混匀;样本消化:向样本中加入20μlProteinaseK和300μlBufferDCL,振荡混匀30sec;65℃水浴5min15min,期间颠倒混匀3次;核酸纯化:裂解结合:向处理液中加入20μlMagUltraBeads和350μl异丙醇,振荡混匀5min,室温静置2min;去除蛋白质:BufferWA漂洗2次;去除盐离子:BufferWB漂洗1次;去除乙醇:弃尽上清,室温晾干10-15min;洗脱核酸:加入50-100μlElutionBuffer,75℃水浴5min洗脱核酸;S3、基因组打断处理:选用诺唯赞TD501基因组打断试剂盒。取50ng纯化核酸按照表2配制试剂体系,室温解冻5×转座酶反应缓冲液,上下颠倒混匀后备用。确认5×终止反应缓冲液是否处于室温,并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀,37℃加热并涡旋振荡混匀,沉淀即可溶解。使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。将反应管置于PCR仪中,运行如下反应程序表3;片段化产物使用VAHTSDNACleanBeads进行纯化,选择基因组片段大小在1-2kbp; 表2:反应试剂体系 表3:扩增反应程序S4、接头连接和纳米孔测序Barcode连接:设计一个新型“Y”型接头,来提高barcode连接效率。使用R1SP和R2SP引物R1SP:5’-TGTACATCATTATATACGTCGCTCTTCCG-3’;R2SP:5’TTGACGTCATGCCAAGGCAGCTCTTCCG-3’连接上述片段化以后得到的核酸和纳米孔Barcode;S5、探针杂交捕获:根据上述panel基因的外显子区域设计特异性探针,由艾吉泰康公司进行设计合成。然后使用配套的探针杂交捕获试剂盒TargetSeqOneHybWashKitv2.0。流程如下:1前处理:将HybHumanBlock、RNaseBlock从-20℃的冰箱中取出,置于冰盒上融化,融化后短暂涡旋混匀并瞬时离心,置于冰盒上暂存;将配套的TargetSeqBlockingOligo从-20℃的冰箱中取出,置于冰盒上融化,短暂涡旋混匀并瞬时离心,置于冰盒上暂存;将需要用到的探针从-20℃冰箱取出,置于冰盒上融化,短暂涡旋混匀并瞬时离心,置于冰盒上暂存;将要进行杂交捕获的文库从-20℃的冰箱中取出,置于冰盒上融化,短暂涡旋混匀并瞬时离心,置于冰盒上暂存;将TargetSeqOneHybBufferv2取出,室温融化,短暂涡旋混匀并瞬时离心,需要将TargetSeqOneHybBufferv2置于37℃水浴锅中加热,待试剂完全溶解后再使用。2探针和纯化带有接头核酸杂交:取750ng接头核酸加入PCR管中,做好标记;将PCR管放入真空浓缩离心机,打开PCR管盖,浓缩至干燥状态;文库浓缩完成后,按下表4配制杂交反应体系;将杂交反应液加入到干燥的文库中,涡旋振荡30s以确保干燥在管底的DNA溶解,并短暂离心;设置PCR仪参数如下,将杂交反应液置于PCR仪上,按照下表5运行程序;建议杂交时间为12~18h,程序结束前30min进行纯化。 表4:配制杂交反应体系 表5:杂交扩增反应体系3目标区域捕获及纯化:①保持STEP2的杂交产物在PCR仪上,将STEP3准备好的180μLCapBeads加入到杂交产物中,吸打混匀;②盖好管盖,将PCR管从PCR仪上取下,置于垂直旋转混匀仪上,转速不超过10rpm,室温结合30min如果实验室无垂直翻转混匀仪,可以在室温下结合30min,期间每隔5min上下颠倒数次混匀;③将PCR管取下,瞬时离心,置于磁力架上2min,待溶液澄清后,移弃上清液;④从磁力架上取下PCR管,向PCR管内加入150μL的WashBuffer1,轻轻吸打混匀,以重悬磁珠,更换新的管盖,然后置于垂直旋转混匀仪上室温清洗15min,转速不超过10rpm;⑤将PCR管取下,瞬时离心,置于磁力架上2min,待溶液澄清后,移弃上清液;⑥从磁力架上取下PCR管,加入150μL60℃预热的TargetSeqOneWashBuf-fer2v2,轻轻吸打混匀,瞬时离心,置于恒温振荡混匀仪或金属浴上,60℃孵育10min;⑦将PCR管取下,瞬时离心,置于磁力架上2min,待溶液澄清后,移弃上清液;⑧重复步骤67一次;⑨从磁力架上取下PCR管,加入150μL60℃预热的TargetSeqOneWashBuffer2v2,轻轻吸打混匀,瞬时离心,置于恒温振荡混匀仪或金属浴上,60℃孵育10min;⑩将PCR管取下,瞬时离心,轻轻吸打混匀,将全部液体包含磁珠转移到新的PCR管中,置于磁力架上2min,待溶液澄清后,移弃上清液; 保持PCR管在磁力架上,向PCR管内加入200μL80%乙醇,静置30s后彻底移弃乙醇溶液可用10μL移液器移弃残留乙醇,室温晾干磁珠使残留的乙醇完全挥发; 向PCR管加入24μLNuclease-FreeWater,从磁力架上取下PCR管,短暂涡旋重悬混匀磁珠,进行纯化。S6、上机测序:将上述纯化好的核酸,使用NanoporeGridION测序仪进行测序,使用配套的测序试剂盒ONTSDK114。测序时长为16-24h;S7、生信数据分析:将basecalling以后得到的纳米孔测序的原始FAST5格式数据通过dorado软件进行处理,以识别碱基并分离条形码,从而为每个样本生成相应的FASTQ文件。利用bowtie2将FastQ文件转化为BAM文件,代码为bowtie2-xindexA28375681.fastq-Sbowtie.samSamtoolsview-bSbowtie.sam-obowtie.bamSamtoolssort-bowtie.sam-obowtie.sorted.bamSamtoolsindexbowtie.sorted.bam然后使用FreeBayes进行数据分析,这是一个用于基因组变异检测和单核苷酸多态性SingleNucleotidePolymorphism,SNP分析的开源软件工具,它能够从下一代测序数据中准确地鉴定出SNP、小片段插入删除indel和结构变异等基因组变异。将上述FASTQ文件导入,最后得到生成基因型数据的摘要统计信息VCF文件,代码为:freesbayes--referencegenome.fainput.bamvariants.vcf。然后使用vcftools确认具体变异情况。
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