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申请/专利权人：山东华宜生物科技有限公司

摘要：本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法。本发明的发酵方法分为酵母菌活化，驯化，接种发酵和纯化等步骤，且制备了特殊的底层填充凝胶的发酵培养基，配合金属离子溶液，实现了增强酶活并同时交联凝胶基质的协同作用，分析了盐析、离子层析、凝胶过滤等多种纯化方式，选择了最优条件，制备了高纯度高酶活的乳酸脱氢酶，是一种短周期产酶，高纯度提酶，更适用于工业化、规模化生产的新型乳酸脱氢酶发酵制备方式。

主权项：1.一种利用酵母菌发酵制备乳酸脱氢酶的方法，步骤如下：1酵母菌置于培养基A进行2次活化；2将活化后的酵母菌原始菌种接入培养基B，培养24～48h，得到液体菌液；3液体菌液按110mL～18mL接入凝胶发酵培养基，再加入总浓度为0.5mmolL～1.5mmolL的金属离子化合物溶液，所述金属离子化合物的金属离子包括Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Fe3+中的至少一种，培养24h～48h；4培养完成后，将凝胶发酵培养基用缓冲液洗脱，得发酵液，离心，洗涤，收集沉淀细胞；5将沉淀细胞破碎，离心，收集上清液，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；6将得到的乳酸脱氢酶粗酶液纯化，即得到乳酸脱氢酶，纯化方式包括盐析、透析抽取、离子层析和凝胶过滤；步骤1中，培养基A为麦芽汁液体培养基，组分包括麦芽膏粉、琼脂粉、氯霉素和蒸馏水，其中按质量比，麦芽膏粉：琼脂粉：氯霉素为1000～1300：100～150：1；步骤2中，培养基B为基础培养基，组分包括麦芽糖、酵母粉、琼脂粉、NaCl、KH2PO4·H2O、MgSO4、蒸馏水，其中按质量比，麦芽糖：酵母粉：琼脂粉：NaCl、KH2PO4·H2O、MgSO4为8～10：5～10：2～3：1：2：1。步骤3中，凝胶发酵培养基组分包括蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、KH2PO4·H2O、吐温60、MgSO4、NaCl、丙酸钠，其中按质量比，蛋白胨：酵母粉：葡萄糖：KH2PO4·H2O：吐温60：MgSO4：NaCl：丙酸钠为4～6：3～4：90～100：1～2：3～6：1：1：1.5～2；所述凝胶发酵培养基为底层填充有凝胶的发酵培养基，凝胶占发酵培养基总容量的16～15；接入液体菌液后，再加入总浓度为0.5mmolL～1.5mmolL的金属离子化合物溶液，所述金属离子化合物的金属离子包括Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+和Fe3+中的至少一种，由流量控制器按10mLmin加入发酵培养基至凝胶-培养液离子迁移速率平衡；所述凝胶的基质为黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、瓜尔胶中的至少一种。

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