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申请/专利权人：中国科学院天津工业生物技术研究所

摘要：本发明公开了乙醇酸的生产方法。本发明提供了一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括使受体菌表达3‑磷酸甘油醛脱氢酶GapC的步骤；还包括对所述受体菌进行如下改造的步骤：抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达、抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达、和或表达乙醛酸还原酶YcdW；所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。本发明所构建的大肠杆菌工程菌NZ‑G466在利用葡萄糖生产乙醇酸的摇瓶发酵试验中，乙醇酸产量可达5.3gL，葡萄糖到乙醇酸转化率可达1.89molmol。本发明对于葡萄糖合成乙醇酸具有重要意义。

主权项：1.一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括如下步骤（A1）：（A1）使受体菌表达3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株；所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源；所述方法还包括如下步骤（A2）：（A2）以所述工程菌1为出发菌株，抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株；所述方法还包括如下步骤（A3）：（A3）以所述工程菌2为出发菌株，抑制其内源苹果酸合酶AceB、乙醇酸脱氢酶AdhE、醛脱氢酶AldA、乳酸脱氢酶LdhA、甲基已二醛合酶MgsA、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta、丙酮酸氧化酶PoxB的表达，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株；所述方法还包括如下步骤（A4）：（A4）以所述工程菌3为出发菌株，表达T7RNA聚合酶并抑制内源鼠李糖降解途径酶RhaBAD的表达，将T7启动子整合于基因组中乙醛酸还原酶YcdW编码基因的起始密码子前，表达乙醛酸还原酶YcdW并抑制内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，抑制内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，增强内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因的表达，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株；所述方法还包括如下步骤（A5）：（A5）以所述工程菌4为出发菌株，抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达，所得菌株命名为工程菌5；所述工程菌5为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株；在所述步骤（A1）中，使所述受体菌表达所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，通过如下实现：用所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因替换所述受体菌基因组中所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的编码基因；所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC为源于丙酮丁酸梭菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC；所述步骤（A2）为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的异柠檬酸脱氢酶ICDH的编码基因，所得菌株即为所述工程菌2；所述步骤（A3）为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中的苹果酸合酶AceB的编码基因、乙醇酸脱氢酶AdhE的编码基因、醛脱氢酶AldA的编码基因、乳酸脱氢酶LdhA的编码基因、甲基已二醛合酶MgsA的编码基因、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta的编码基因、丙酮酸氧化酶PoxB的编码基因，所得菌株即为所述工程菌3；在所述步骤（A4）中，表达所述T7RNA聚合酶并抑制所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的表达，通过如下实现：将所述T7RNA聚合酶的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的编码基因位置处；所述T7RNA聚合酶的编码基因的表达盒中启动所述T7RNA聚合酶的编码基因转录的启动子为Ptrc启动子；所述T7RNA聚合酶为来源于大肠杆菌BL21DE3的T7RNA聚合酶；在所述步骤（A4）中，表达所述乙醛酸还原酶YcdW并抑制所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，通过如下实现：将所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的编码基因位置处；所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因的表达盒中启动所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因转录的启动子为T7启动子；所述乙醛酸还原酶YcdW为内源乙醛酸还原酶YcdW；在所述步骤（A4）中，抑制所述内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，通过如下实现：敲除基因组中的所述DNA结合转录阻遏物IclR的编码基因；在所述步骤（A4）中，增强所述内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因表达是通过如下实现的：采用核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的含有RBS序列的启动子片段启动所述异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因的表达；所述步骤（A5）为：以所述工程菌4为出发菌株，敲除基因组中的NADPH转氢酶SthA的编码基因，所得菌株即为所述工程菌5；所述受体菌为大肠杆菌；所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC为氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白质，或为在SEQIDNo.1所示的蛋白质的N端和或C端连接标签后得到的融合蛋白；所述T7RNA聚合酶为氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白质，或为在SEQIDNo.2所示的蛋白质的N端和或C端连接标签后得到的融合蛋白；所述乙醛酸还原酶YcdW为氨基酸序列如SEQIDNo.3所示的蛋白质，或为在SEQIDNo.3所示的蛋白质的N端和或C端连接标签后得到的融合蛋白。

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