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申请/专利权人：中国科学院海洋研究所

摘要：本发明属于水产养殖病害防控领域，具体的说是涉及一种利用Dot‑ELISA检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法。采用Dot‑ELISA方法，以通过抗体芯片杂交技术筛选获得的IgG作为血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体，进而检测三疣梭子蟹被血卵涡鞭虫的感染情况。该检测方法具有特异性强、灵敏度高、结果容易辨别判定，且检测结果便于长期保存等特点，可对养殖三疣梭子蟹进行大规模的采样调查和检测，为三疣梭子蟹养殖过程中血卵涡鞭虫引发的“牛奶病”的流行发生进行预警预报，并为及时采取针对血卵涡鞭虫流行性病害的防控措施提供技术支撑。

主权项：1.一种检测三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫的方法，其特征在于：采用Dot-ELISA方法，以通过抗体芯片杂交技术筛选获得的IgG作为血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体，进而检测三疣梭子蟹被血卵涡鞭虫的感染情况；所述血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体的获得：将0.05g血卵涡鞭虫细胞破碎，破碎后加入2mL天然法裂解液和20μL蛋白酶抑制剂，充分裂解而后经超声处理，离心收集上清液即为抗原，将抗原进一步加入抗体芯片进行抗原-抗体杂交反应，即筛选获得特异性抗体；其中，破碎后细胞、天然法裂解液和蛋白酶抑制剂之间按1g：40mL：0.4μL的比例混合；其中抗体芯片为Mabarray1.0,Abmart；Dot-ELISA方法具体为：（1）血淋巴样品研磨：取待检测三疣梭子蟹的血淋巴样品经氧化锆研磨珠充分研磨，离心收集上清液；（2）将上述收集的上清液滴至活化后硝酸纤维素膜上，使硝酸纤维素膜吸收上清液，然后经1xTBST反复清洗膜片；（3）封闭：将膜片置于细胞培养板内加入5%脱脂牛奶进行封闭，室温放置30-60min；（4）孵育一抗：弃细胞培养板中的溶液，采用1xTBST反复洗涤，滴加稀释后的血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体覆盖硝酸纤维素膜，室温孵育45-60min；其中，血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体经含5%脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释；所述血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体与缓冲液稀释体积比为1:1500-2500稀释；（5）孵育二抗：弃去细胞培养板中的液体，采用1xTBST反复冲洗硝酸纤维素膜，滴加稀释后的羊抗鼠AP-IgG二抗覆盖硝酸纤维素膜，室温孵育30-40min；其中，羊抗鼠AP-IgG二抗中稀释液为含5%脱脂牛奶的PBST缓冲液，二抗与稀释液体积比为1:3000-4000；（6）显色反应：弃掉溶液，1xTBST反复洗涤硝酸纤维素膜，然后将硝酸纤维素膜浸入显色反应工作液中，黑暗室温条件下，置于摇床上平缓摇动进行孵育反应20-30min后，将硝酸纤维素膜浸入去离子水中终止反应，然后将膜取出晾干，观察记录结果；硝酸纤维素膜中央处样品呈现出深蓝色或蓝紫色，说明三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫。

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