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申请/专利权人：云南中茶茶业有限公司

摘要：本发明属于普洱茶生产技术及产品品质改善领域，具体涉及一种新型黑曲霉菌株及其在普洱茶加工工艺中的应用。本发明所述的新型黑曲霉，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15883。本发明所述的新型黑曲霉菌株应用于普洱茶加工工艺中，能够加速发酵，缩短发酵时间，能够保证产品品质稳定，且有助于加速普洱茶的后期转化。

主权项：1.一种新黑曲霉0048-AN，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15883。

全文数据：一种新型黑曲霉菌株及其在普洱茶加工工艺中的应用技术领域本发明属于普洱茶生产技术及产品品质改善领域，涉及一种新型黑曲霉0048-AN及其在普洱茶加工工艺中的应用。背景技术普洱茶以云南大叶种晒青茶为原料制成，被认为是变化最丰富、最有故事的中国茶。普洱熟茶属于后发酵茶，是以晒青毛茶为原料经过一个月以上的渥堆发酵制得。普洱茶最重要的特征是随着储藏时间的延长，茶叶的口感香气等特征会发生变化，并呈现越来越好的口感。因此，随着普洱茶储藏时间的延长，普洱茶的价值和价格都会显著增加。新型黑曲霉与黑曲霉极为相近，通过分子测序技术能够区别新型黑曲霉和黑曲霉，二者在菌株特性上有所区别，但目前很多研究都将二者混淆。此外，在普洱茶发酵研究领域对于新型黑曲霉研究很少，研究其在普洱茶发酵中的加工工艺中的应用具有重要意义。发明内容为此，本发明所要解决的技术问题在于通过测序技术明确菌株，并其在普洱茶生产中的重要作用进行研究，缩短生产发酵周期，稳定品质，加速后期陈化转变，提高了普洱茶中茶褐素含量。为解决上述技术问题，本发明所述的一种新型黑曲霉菌株0048-AN，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15883。通过分子测序的ITS基因序列，钙调蛋白基因序列和β微管蛋白基因序列，并结合菌株微观形态和宏观形态结果，进行菌株鉴定，确认为新型黑曲霉。新型黑曲霉CGMCCNo.15883于28度在PDA培养基上培养36-48小时后开始生长，7天后菌落达到8cm，形成黑色致密且发达的菌丝，其形态与黑曲霉极为相近。本发明所述的新型黑曲霉菌株0048-AN遗传稳定，符合普洱茶高温汽蒸等生产要求，筛选分离包括如下步骤：1、选取五年普洱产品、十年普洱产品进行取样并粉碎稀释，同时在昆明中茶普洱茶储存仓分别选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样法进行取样；2、将取样后的样品于PDA固体培养基进行培养，于28-30℃条件下培养10天进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取代表性菌落，菌落形态相互区别的菌落进行下一步纯化；4、挑取筛选菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30℃条件下培养5-10天，直至得到各个菌株的单菌落；5、将获得的菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，在20-75℃生存，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株。利用上述新型黑曲霉菌株制备液体种子，所述的液体种子是在渥堆发酵工序前接入所述保藏编号为CGMCCNo.15883的单一菌种经培养后得到的液体种子，通过如下方法制备：1、取活化后的新型黑曲霉CGMCCNo.15883菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基。2、于27-30℃条件下，在无菌条件下于摇床中培养2-4天。液体种子的密度为2-10*105cfumL以上。本发明菌株应用于普洱茶生产加工中，对普洱茶的品质转化起到很大的积极作用，能够缩短生产发酵周期，有助于将小分子儿茶素氧化为大分子茶色素，茶褐素含量提高，普洱茶口感更为丰富醇和；同时能够加快普洱茶存放期间的陈化速度。所述普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥，按如下方法进行：1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；2、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，将菌液均匀喷洒到茶叶上，接种量为30％-38％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；3、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为3-5*3-5米的茶堆，进行渥堆发酵，堆芯温度在35-45度左右，堆表面温度为25-30度，水分含量在40％-50％左右；4、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；5、发酵17-23天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。具体实施方式本发明下述实施例中所述的PDA固体培养基、PDB液体培养基均按照现有技术中常规方法制备。本发明中新型黑曲霉的选育方法，包括如下步骤：1、选取五年普洱产品、十年普洱产品进行取样并粉碎稀释，同时在昆明中茶普洱茶储存仓分别选取20个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样法进行取样；2、将取样后的样品于PDA固体培养基进行培养，于28℃条件下培养10天进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；3、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取代表性菌落，菌落形态相互区别的菌落进行下一步纯化；4、挑取筛选菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28℃条件下培养7天，直至得到各个菌株的单菌落共计50株；5、进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，在20-75℃生存，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株。将由上述步骤中分离得到的菌株0048-AN，进行宏观和微观的形态学鉴定，同时结合ITS基因序列，钙调蛋白基因序列和β微管蛋白基因序列的分子生物学鉴定，鉴定结果为新型黑曲霉。该菌株遗传稳定性稳定，有良好的耐热性，符合生产要求，送样编号为0048-AN，菌株于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15883，Aspergillusneoniger。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年6月19日，目前状态为存活。将该菌株用于普洱茶发酵生产，在常规工艺中增加制备液体种子和接种步骤，增加后的工艺为毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥、压制成型。所述的液体种子是利用新型黑曲霉CGMCCNo.15883按照如下方法制备：取活化后的菌株划线接种至液体培养基中，于27-30℃条件下，避光培养2-4天，并在无菌条件下进行培养。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基。所述液体种子的密度为2-10×105cfumL。1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；2、取活化后的新型黑曲霉CGMCCNo.15883菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基；3、于27-30℃条件下，在无菌条件下于摇床中培养2-4天。液体种子的密度为2-10*105cfumL以上；4、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，将菌液均匀喷洒到茶叶上，接种量为30％-38％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；5、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为3-5*3-5米的茶堆，进行渥堆发酵，堆芯温度在35-45度左右，堆表面温度为25-30度，水分含量在40％-50％左右；6、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；7、发酵17-23天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。实施例1专利普洱茶按照本发明的方法进行单菌株发酵，制备普洱熟茶，包括如下步骤：1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；2、取活化后的新型黑曲霉CGMCCNo.15883菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基；3、于28℃条件下，在无菌条件下于摇床中培养2天。液体种子的密度为5*105cfumL以上；4、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，将菌液均匀喷洒到茶叶上，接种量为37％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；5、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为5*5米的茶堆，进行渥堆发酵，堆芯温度在35度左右，堆表面温度为25度，水分含量在45％左右；6、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；7、发酵19天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。本实施例制备的普洱熟茶，品质稳定，其滋味醇厚，茶多酚快速转化，茶褐素含量进一步增加。本实施例的产品在昆明中茶存储仓存放2年，陈香明显，新型黑曲霉有利于滋味香气的转化。对比例1常规普洱茶按照《地理标志产品-普洱茶》GBT22111中记载，将茶叶原料制备为普洱熟茶，发酵周期为40天。对比例2黑曲霉制备普洱茶按照本发明的方法进行单菌株发酵，制备普洱熟茶，包括如下步骤：1、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；2、取活化后的黑曲霉接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基；3、于28℃条件下，在无菌条件下于摇床中培养2天。液体种子的密度为5*105cfumL以上；4、将制备的液体种子接种到茶叶原料中，将菌液均匀喷洒到茶叶上，接种量为37％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；5、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为5*5米的茶堆，进行渥堆发酵，堆芯温度在35度左右，堆表面温度为25度，水分含量在40％-50％左右；6、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；7、发酵19天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。分别将上述实施例及对比例中的普洱熟普保存2年，并对储存前后的普洱熟茶的成分和品质进行检测和评审。茶多酚在一定范围内向其他物质的转变速度代表了茶叶转化的速度，因此，实验中以茶多酚和茶褐素茶多酚转化产物含量表示茶叶转化速度。普洱茶的促消化功能也是评价品质的一个方面，因此对两个样品进行促淀粉消化能力的检测。检测结果分别记录于下表1。表1普洱熟茶品质的检测结果由表1的普洱熟茶数据可知，实施例1的茶褐素含量高于对比例1和2，茶叶的香气和滋味更优。在转化速度上，存放两年后实施例1的转化效率及其活性能力促淀粉消化能力明显高于对比例1和2，实施例1的茶褐素含量也远远高于对比例。总体而言，利用新型黑曲霉制备的实施例1的香气和滋味整体优于对比例，且转化效率高于常规发酵及其他菌株的发酵效果。新型黑曲霉对普洱茶的品质转化起到很大的积极作用，能够缩短生产发酵周期，有助于将小分子儿茶素氧化为大分子茶色素，茶褐素含量提高，具有较好的促消化能力，同时普洱茶口感更为丰富醇和；同时能够加快普洱茶存放期间的陈化速度。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

权利要求：1.一种新型黑曲霉0048-AN，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.15883。2.根据权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于，由昆明中茶普洱茶存储仓或陈年普洱茶产品中分离纯化得到，遗传稳定，符合普洱茶高温汽蒸等生产要求的菌株，包括如下步骤：S11、选取五年普洱产品、十年普洱产品进行取样并粉碎稀释，同时在昆明中茶普洱茶储存仓分别选取几个地点，利用空气沉降法和表面涂抹取样法进行取样；S12、将取样后的样品于PDA固体培养基进行培养，于28-30℃条件下培养10天进行倒置培养，同时进行空白对照组培养，记录菌落生长情况；S13、记录菌落生长情况，进行菌落识别；选取菌落形态相互区别的菌落进行下一步纯化；S14、挑取S13筛选菌落划线接种至PDA固体培养基上，于28-30℃条件下培养5-10天，直至得到各个菌株的单菌落；S15、将S14获得的菌株进行菌株鉴定，挑选能够在20-45℃生长，在20-75℃生存，可应用于普洱茶生产，抑制杂菌能力强，且遗传稳定的菌株，其保藏编号为CGMCCNo.15883。3.根据权利要求2所述的新型黑曲霉菌株制备液体种子其特征在于，所述的液体种子是在渥堆发酵工序前接入所述保藏编号为CGMCCNo.15883的单一菌种经培养后得到的液体种子，通过如下方法制备：S21、取活化后的新型黑曲霉CGMCCNo.15883菌株接种至液体培养基。所述的液体培养基包括PDB液体培养基以及利用茶叶、茶粉制备茶汁的液体培养基；S22、于27-30℃条件下，在无菌条件下于摇床中培养2-4天。所述液体种子的密度为2-10*105cfumL以上。4.根据权利要求3所述的工艺制备含有新型黑曲霉菌株的普洱茶产品，其特征在于，利用新型黑曲霉CGMCCNo.15883菌株接种制备普洱茶产品，所述普洱工艺包括毛茶拼配、混料、喷洒接种、渥堆发酵、翻堆、开沟干燥，按如下方法进行：S31、将不同原料按要求进行拼配、混匀后，要求混料后茶叶无花杂；S32、将权利要求3制备的液体种子接种到茶叶原料中，将菌液均匀喷洒到茶叶上，接种量为30％-38％，菌液喷洒均匀、茶叶不结块；S33、将接种后的茶叶堆放成高0.5米、长宽为3-5*3-5米的茶堆，进行渥堆发酵，堆芯温度在35-45度左右，堆表面温度为25-30度，水分含量在40％-50％左右；S34、每隔5天翻堆一次，让堆芯茶叶与堆表茶叶混合均匀，并保持堆芯温度以及水分含量；S35、发酵17-23天后，在茶堆上开沟，进行通风干燥。

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