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申请/专利权人：杭州师范大学

摘要：本发明是一种氨基微球有序固定多酶的方法、其产物和应用，属于基因工程、酶固定化和生物催化技术领域。所述方法包括：制备多孔氨基化固定化载体；制备融合蛋白QT‑PPK‑DC，SC‑FucT2‑DC，Fkp‑ST；往多孔氨基化固定化载体中加入QT‑PPK‑DC，并加入谷氨酰胺转胺酶MTG；将得到的产物重新分散到SC‑FucT2‑DC中；将得到的产物重新分散到Fkp‑ST中，得到三酶有序固定化氨基微球，并将微球用于合成2‑岩藻糖基乳糖中，最终在初步催化中即得到4.17gL的2’‑岩藻糖基乳糖。本发明的优点：多酶固定化的方向以及顺序可控，参与级联反应的酶蛋白之间催化活性口袋距离较近，进一步提高催化效率；生物正交化学的固定方式中使用细胞破碎液上清，同步固定与纯化且自然温和，在很大程度上保留了酶蛋白的催化活性。

主权项：1.一种氨基微球有序固定多酶的方法，包括以下几个步骤：1、制备多孔氨基化固定化载体，所述多孔氨基固定化载体为表面富含氨基的多孔聚合物微球；2、在聚磷酸激酶PPK上分别融合DogTag与QTag、在岩藻糖基转移酶FucT2上分别融合DogCatcher与SpyCatcher、在GDP-岩藻糖焦磷酸化酶Fkp上融合SpyTag，得到融合蛋白QT-PPK-DT，SC-FucT2-DC，Fkp-ST；3、往步骤1的多孔氨基化固定化载体中加入步骤2的QT-PPK-DC融合蛋白，并加入谷氨酰胺转胺酶MTG，使QT-PPK-DT融合酶蛋白上的QTag与多孔氨基化固定化载体上的氨基树脂发生反应进行特异性固定，具体步骤为：在谷氨酰胺转胺酶MTG的作用下，氨基树脂上富含的氨基与QTag上的酰胺发生反应，从而实现氨基载体对第一个酶蛋白聚磷酸激的固定；QT-PPK-DT通过MTG固定到氨基微球上时，混合的QT-PPK-DC与MTG的比例为5～10:1，反应时间为1～10h；4、将步骤3得到的产物重新分散到步骤2的SC-FucT2-DC融合蛋白中，使QT-PPK-DT上的DogTag和SC-FucT2-DC上的DogCatcher进行生物正交，实现对第二个酶蛋白的固定；5、将步骤4得到的产物重新分散到步骤2中得到的Fkp-ST融合蛋白中，使SC-FucT2-DC上的SpyCatcher与Fkp-ST上的SpyTag进行生物正交，实现在固定化载体上形成三酶有序固定涂层；所述的聚磷酸激酶来源于土拉伦氏弗朗西斯菌Francisellatularensis，编码基因序列如SEQIDNo.1所示；；所述的岩藻糖基转移酶来源于嗜热链球菌Thermosynechococcusvestitus，编码基因序列如SEQIDNo.3所示；所述的GDP-岩藻糖焦磷酸化酶来源于脆弱拟杆菌Bacteroidesfragilis，编码基因序列如SEQIDNo.2第14位-第2863位所示；所述的谷氨酰胺转胺酶来源于茂原链霉菌Streptomycesmobaraensis，编码基因序列如SEQIDNo.4所示；所述DogCatcher的编码基因序列如SEQIDNo.5所示；所述DogTag的编码基因序列如SEQIDNo.6；所述SpyCatcher的编码基因序列如SEQIDNo.7；所述SpyTag的编码基因序列如SEQIDNo.8和所述Qtag的编码基因序列如SEQIDNo.9所示。

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