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申请/专利权人：儿童医疗中心有限公司

摘要：本实施方式提供免疫原性多抗原提呈系统，所述免疫原性多抗原提呈系统包含聚合物，抗原通过互补亲和分子缔合至所述聚合物。例如，所述聚合物可为多糖、或抗原性多糖，来自相同或不同病原体的蛋白抗原或肽抗原间接连接至所述聚合物。本发明的免疫原性组合物可同时引发针对一种或多种抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答两种免疫应答。

主权项：1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含：免疫有效量的至少一种抗原性多糖，其中，所述抗原性多糖交联至生物素或者共价键合至生物素，其中，所述至少一种抗原性多糖选自于由以下所组成的组：肺炎链球菌血清型1荚膜多糖、肺炎链球菌血清型5荚膜多糖和肺炎链球菌血清型14荚膜多糖，以及免疫有效量的融合蛋白的二聚体，其中，每个融合蛋白包含至少一种肽或多肽抗原和rhizavidin，其中，所述生物素与所述rhizavidin非共价缔合，从而连接所述肽或多肽抗原和所述抗原性多糖；其中，在将所述免疫原性组合物给予至受试者之后，所述免疫有效量的至少一种抗原性多糖足以至少引起针对所述抗原性多糖的抗体或B细胞应答；以及其中，在将所述免疫原性组合物给予至同一受试者之后，所述免疫有效量的融合蛋白的二聚体足以引起：针对所述肽或多肽抗原的T细胞应答，针对所述肽或多肽抗原的抗体或B细胞应答，或者针对所述肽或多肽抗原的T细胞应答与抗体或B细胞应答的组合。

全文数据：多抗原提呈免疫原性组合物及其方法和用途[0001]本申请是申请日为2012年5月11日、发明名称为“多抗原提呈免疫原性组合物及其方法和用途”的申请号为201280034406.0的专利申请的分案申请。[0002]相关申请的交叉引用[0003][0004][0005]根据35U.S.C.§119e，本申请要求2011年5月11日提交的美国临时申请号61484,934、2012年3月8日提交的美国临时申请号61608,168以及2012年3月13日提交的美国临时申请号61609,974的优先权，以引用的方式将其各自的内容全部并入本文。技术领域[0006]本发明涉及分子遗传学、免疫学和微生物学。本申请总体上针对用于制备免疫原性组合物的方法以及组合物。更具体地说，本发明的实施方式提供免疫原性大分子-复合物macro-complex，所述免疫原性大分子-复合物包含连接至聚合物如多糖）（也可为抗原）的至少一种蛋白或肽抗原。在一些实施方式中，可将这种复合物用作免疫原性组合物例如疫苗）以赋予协同的体液免疫应答和细胞免疫应答;在一些实施方式中，引发协同的抗体介导的和细胞介导的针对病原体的防护，例如，此类病原体的致死感染和粘膜运输mucosalcarriage〇背景技术[0007]疫苗提供对各种疾病的预防和治疗，包括微生物感染、病毒感染和癌症。然而，目前基于多糖的疫苗在多数易感人群vulnerablepopulations中并不总是有效。例如，在发展中国家中，肺炎链球菌（Streptococcuspneumonia，肺炎球菌）感染和伤寒沙门氏菌Salmonellatyphi感染是儿童的两种主要疾病。对于伤寒typhoidfever，许可的Vi多糖疫苗对两岁以下的儿童无效。然而，基于多糖的疫苗的成功和防止定殖CoIonization或疾病的被动免疫已表明了荚膜抗体的重要性，特别是在对由肺炎链球菌引起的疾病进行控制这一方面。此外，对动物和人二者的研究表明由肺炎球菌接种vaccination引发的抗体可以保护免于鼻咽NP肺炎球菌定殖，其在肺炎球菌疾病之前发生。[0008]当前多糖肺炎球菌疫苗的局限在于，抗荚膜抗体给予的保护受到其血清型特异性限制。例如，尽管7价肺炎球菌缀合疫苗PCV7由于疫苗型VT菌株显著地降低了侵袭性肺炎链球菌疾病（invasivepneumococcaldisease的发病率，但是最近的研究表明非VT血清型已逐渐取代了VT肺炎球菌群，潜在地限制疫苗的有效性。这已导致对是否可以通过保守性抗原的免疫（immunization来防止肺炎球菌定殖进行评价。特别是，若干肺炎球菌蛋白在肺炎球菌定殖动物模型中已被评价为候选疫苗。已经证明，以这些蛋白中的一些进行的粘膜免疫引发全身性抗体和粘膜抗体，并赋予针对肺炎球菌疾病和定殖的保护。仍然需要含有肺炎球菌多糖和蛋白二者的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物能够产生针对所有肺炎球菌血清型的稳健的robust细胞免疫应答和体液免疫应答这两种免疫应答。[0009]此外，固有免疫应答提供了针对微生物病原体的迅速且通常有效的防御。这种应答包括对病原体相关分子的细胞识别、触发炎症介质（inflammatorymediators的产生和释放、白细胞的募集、以及抗菌效应物的活化。Toll样受体TLR能够在多种病原体相关分子之间进行识别并引发保护性应答，就哺乳动物而言已经描述了其中至少十一种。例如，TLR4识别许多微生物产物，包括来自革兰氏阴性菌的微生物产物、呼吸道合胞病毒的F蛋白以及革兰氏阳性菌的胆固醇依赖细胞溶素（CDC，cholesterol-dependentcytolysins。此外，TLR2识别大量的微生物化合物和合成化合物。因此，纳入此类TLR激动剂可增强对疫苗的免疫应答。仍有需要通过引发针对感染例如肺炎球菌的定殖和疾病）的固有免疫应答TLR介导的或其它的应答来改善疫苗的效力。发明内容[0010]本发明提供了免疫原性多抗原提呈系统MAPS，该免疫原性多抗原提呈系统对免疫原性组合物例如，在疫苗中有用的组合物）的生产有用。特别地，本发明涉及含有免疫原性复合物（immunogeniccomplex的组合物，所述免疫原性复合物含有至少一种类型的聚合物例如多糖），所述聚合物可任选为抗原性的；至少一种抗原蛋白或抗原肽；以及至少一种互补亲和分子对，所述互补亲和分子对含有（i与所述聚合物缔合（associatewith的第一亲和分子，以及（ii与所述蛋白或肽缔合的互补亲和分子，以使得所述第一亲和分子和互补亲和分子作为所述聚合物与所述抗原蛋白或抗原肽之间的间接连接。因此，所述聚合物可连接至少1种、或至少2种、或多种相同或不同的蛋白抗原或肽抗原。在一些实施方式中，所述聚合物为抗原性的，例如，所述聚合物为肺炎球菌荚膜多糖。在一些实施方式中，所述蛋白抗原或肽抗原为重组蛋白抗原或肽抗原。[0011]本文所公开的免疫原性组合物可同时引发针对一种或多种抗原的体液应答和细胞应答这两种应答。所述免疫原性组合物提供了长期记忆应答，潜在地保护受试者免于以后的感染。这允许单个免疫原性组合物产生高效价titer的功能性抗多糖抗体，并使其诱发的抗体水平类似于或高于由传统缀合疫苗诱发的抗体水平。此外，对具体的载体蛋白没有限制，并且多种抗原蛋白可用于MAPS构建体中来生成稳健的抗多糖抗体应答。此外，强烈的抗体应答和Thl7Thl应答对经由所述MAPS组合物提呈的多种蛋白抗原具有特异性。这呈现出作为用一种构建体引发两种形式的免疫的手段的主要优点。除了针对缀合至蛋白载体的抗原多糖的更传统的免疫应答之外，本发明提供了针对全身性注射的蛋白的T细胞应答以及，更具体地说，为Thl7和Thl应答。此外，本免疫原性组合物可将配体并入到所述聚合物骨架上。这提供了如下潜能:通过改变蛋白聚合物比例、复合物大小，或通过将特定共刺激因子如TLR24配体等）并入所述组合物中，来增强特异性B细胞应答或T细胞应答。[0012]与典型的缀合技术涉及对蛋白的严苛处理）相比，本方法避免了肽抗原的其它修饰的变性风险。这提供了如下很大的优势:保持所包含的蛋白的抗原性，并增加蛋白本身将作为抗原（而不只是载体）的可能性。同样地，本方法避免了对多糖骨架不必要的修饰损坏，因为没有重度化学交联:可精确地控制生物素化以使其与多糖的特定官能团进行反应，并且可容易地对生物素化水平进行调节。这有利于避免缀合的典型过程，所述缀合的典型过程导致关键侧链或表位的损坏，这可能会导致降低的免疫原性和保护。[0013]本发明的基于亲和的组装assembly提供了简单且高度灵活的免疫原性组合物的制备。它高度特异和稳定；它可以在寒冷中保存数月并保持其效力。组装过程足够简单以确保了高重现性;仅需要几个步骤，这降低了批次间存在偏差的风险，并具有巨大的工业优势。即使在低浓度的蛋白和多糖（如〇.lmgml中，MAPS组装也是高效的（超过95%;这是主要优点，因为缀合制造的低效率效率通常在500kDa的分子质量。在本发明的另一方面，所述PS具有30mg每升大肠杆菌培养液。与其它亲和素样蛋白相比，Rhizavidin与卵亲和素具有较低的序列同源性22.4%的序列一致性和35.0%的相似度）。使用修饰的rhizavidin减少了MAPS诱发受试者中卵相关过敏反应的风险。此外，针对重组修饰的rhizavidin的抗体对于卵亲和素没有明显的交叉反应性反之亦然）。[0〃5]更具体而言，一些实施方式包含设计用于在大肠杆菌中重组表达的修饰rhizavidin。使用大肠杆菌表达密码子对rhizavidin基因的编码序列进行优化，以避免由于原始基因中存在的稀有密码子而在大肠杆菌中表达期间产生的任何困难。为简化构建体，在基于生物信息学和结构的分析后，由于发现其对于核心结构和功能而言是非必须的，因此移除了全长rhizavidin的前44个残基。通过在截短型rhizavidin45-179的N端添加大肠杆菌分泌信号序列，提升了重组蛋白的正确折叠，以促进重组蛋白转位translocate进入大肠杆菌细胞的周质空间，在周质空间中对于rhizavidin而言功能重要的二硫键能够正确形成。修饰重组的rhizavidin形成二聚体，与已知的形成四聚体的亲和素样蛋白相比，进一步增强了重组rhizavidin-抗原融合体在大肠杆菌中作为可溶性蛋白的表达。[0176]此外，根据本文其它部分的进一步详细讨论，为改善融合抗原在大肠杆菌中的表达和可溶性，在rhizavidin和抗原蛋白之间添加柔性接头区域。此外，基于生物信息学和结构分析，对不同抗原构建体进行了克隆和表达:全长抗原、或重要的功能结构域、或包含两种不同抗原的嵌合蛋白。[0177]其它可用于本文所述的方法和组合物中的亲和对包括抗原-抗体、金属离子-金属离子结合蛋白、脂质脂质结合蛋白、糖糖结合蛋白、氨基酸肽-氨基酸肽结合蛋白、酶-底物或酶-抑制剂、配体-激动剂受体或生物素模拟物。当使用其它亲和对时，还可使用其它连接相应聚合物与抗原的手段，如体外酶反应而非基因融合。更具体而言，抗原-抗体亲和对提供了非常强且特异性的相互作用。抗原可以是任何表位，包括蛋白质、肽、核酸、脂质、多糖寡糖、离子等。抗体可以是任何类型的免疫球蛋白或免疫球蛋白的Ag结合部分，如Fab片段。关于金属离子-金属离子结合蛋白，实例包括NiNTA与组氨酸标记蛋白、或Zn与Zn结合蛋白。关于脂质脂质结合蛋白，实例包括胆固醇与胆固醇结合蛋白。关于糖糖结合蛋白，实例包括麦芽糖与麦芽糖结合蛋白、甘露糖葡萄糖寡糖与凝集素。酶-底物抑制剂包括来自广泛物质中的底物，包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖或离子。抑制剂可以是实际底物的类似物，通常与酶的结合更紧密，甚至是不可逆的。例如，胰蛋白酶与大豆胰蛋白酶抑制剂。抑制剂可以是天然分子或合成分子。关于其它配体激动剂-受体，配体可来自广泛的物质，包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖或离子，激动剂可以是实际配体的类似物。实例包括LPS与TLR4相互作用。[0178]交联剂[0179]许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子偶联至其它分子。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物，如硫酯thioesters、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和己二胺hexamethylenediamine。该列表并非旨在对本领域已知的各类偶联剂进行穷举，而是示例性地给出最常见的偶联剂。参见KillenLindstrom，133J.Immunol.13351984;Jansen等，62Imm.Rev.1851982;Vitetta等。[0180]在一些实施方式中，涵盖了文献中所描述的交联剂以用于本文公开的方法、免疫原性组合物和试剂盒中。参见例如:Ramakrishnan等，44CancerRes.2011984描述了1^51-马来酰亚胺苯甲酰4-羟基琥珀酰亚胺酯）的使用）；1]111_〇切等，美国专利号5,030，719描述了通过寡肽接头将卤代乙酰肼衍生物偶联至抗体的使用）。特别的接头包括：aEDC1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐）；（bSMPT4-琥珀酰亚胺氧羰基-€[-甲基-€[-2-吡啶基-二硫代-甲苯屮16代6016111.：0.，01215586;35^^琥珀酰亚胺-6[3-2-吡啶基二硫代）丙酰胺基]己酸酯PierceChem.Co.，Cat.#21651G;d硫代-LC-SPDP硫代琥珀酰亚胺6[3-2-吡啶基二硫代）-丙酰胺基]己酸酯（PierceChem.Co.，Cat.#2165-G;以及（f缀合至EDC的硫代-NHSN-羟基硫代琥珀酰亚胺PierceChem.Co.，Cat.#24510〇[0181]上述连接或连接剂含有具有不同作用的成分，因此使缀合物具有不同的生理化学性质。例如，烷基羧酸酯的硫代-NHS酯比芳香族羧酸酯的硫代-NHS酯稳定。含有接头的NHS-酯比硫代-NHS酯难溶。此外，SMPT接头含有空间受阻的二硫键，因此能形成稳定性更高的缀合物。由于二硫键连接在体外可被切割，因此二硫键连接通常比其它连接不稳定，导致可用的缀合物较少。特别而言，硫代-NHS能够增强碳二亚胺偶联的稳定性。与仅使用碳二亚胺偶联反应的情况相比，当与硫代-NHS联合使用时，碳二亚胺偶联例如EDC形成的酯对于水解的耐受性更强。[0182]用于本文公开的免疫原性组合物和方法中的示例性的交联分子包括但不限于列于表3和表4中的分子。[0183]表3:示例性的同双功能交联剂*[0184][0185]表4:示例性的异双功能交联剂*[0186][0187]共刺激因子[0188]在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物包含至少一种共刺激分子。在一些实施方式中，共刺激因子交联至聚合物。在一些实施方式中，共刺激因子通过互补亲和对与聚合物缔合，其类似于抗原与聚合物的缔合。在一些实施方式中，将共刺激因子连接至聚合物的互补亲和对与将抗原连接至聚合物的互补亲和对相同或不同。[0189]在一些实施方式中，可将至少1种、或至少2种、或至少3种、或至少5种、或至少10种、或至少15种、或至少20种、或至少50种、或至少100种、或超过约100种包括端值共刺激因子与本文公开的聚合物缔合。在一些实施方式中，所述共刺激因子可以是相同的共刺激因子，或所述共刺激因子可以是与聚合物缔合的多种不同共刺激因子。[0190]在一些实施方式中，共刺激因子为Toll样受体的配体激动剂，例如但不限于：TLRl、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLRl0、TLRl1等。在一些实施方式中，共刺激因子为NOD配体激动剂、或炎性小体的激活剂激动剂。不希望为理论所限，炎性小体为下列物质所组成的多蛋白寡聚体:半胱天冬酶1、？¥〇4^、财1^，有时为半胱天冬酶5或半胱天冬酶11;并且，炎性小体促进炎性细胞因子白介素l-β和白介素18的成熟。[0191]在一些实施方式中，共刺激因子为细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子选自于由下列细胞因子所组成的组:GM-CSF;IL-Ia;IL-Ιβ;IL-2;IL-3;IL-4;IL-5;IL-6;IL-7;IL-8;IL-10;IL-12;IL-23;IFN-a;IFN-β;IFN-β;IFN-γ;MIP-Ia;ΜΙΡ-1β;TGFUNFa;和TNFK在一些实施方式中，共刺激因子为佐剂，所述佐剂可如先前所讨论地与聚合物缔合，或可在对受试者给药之前或在给药同时添加至MAPS组合物。佐剂在本文的其它部分有进一步描述。[0192]抗原以及融合至互补亲和分子的抗原的生产[0193]重组蛋白可由本领域技术人员或通过使用商购试剂盒方便地进行表达和纯化，所述商购试剂盒例如PROBOND™PurificationSystemInvitrogenCorp.，Carlsbad，CA。在一些实施方式中，重组抗原可使用本领域普通技术人员所知的细菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒（baculovirus昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、或转基因植物或动物系统通过蛋白纯化方法来进行合成和纯化。[0194]本文所述的融合多肽皆可通过本领域技术人员所熟知的蛋白和分子方法进行合成和纯化。使用分子生物学方法和重组异源蛋白表达系统。例如，重组蛋白可在细菌、哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞中，或者在转基因植物或动物宿主中表达。[0195]在一个实施方式中，本文提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本文所述的融合多肽或非融合多肽。可将常规聚合酶链式反应PCR克隆技术用于构建编码本文所述的融合多肽的嵌合编码序列或融合编码序列。可将编码序列克隆进通用克隆载体中，例如pUC19、pBR322、载体（Stratagene，Inc·或pCRTOPO.®Invitrogen。然后，可将生成的重组载体携带有编码本文所述的多肽的核酸）用于进一步的分子生物学操作例如，定点突变），以生成本文所述的变体融合多肽，或者可将其亚克隆进蛋白表达载体或病毒载体，以使用选自于由下列宿主细胞所组成的组中的宿主细胞在多种蛋白表达系统中进行蛋白合成:哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母、细菌和植物细胞。[0196]每个PCR引物应具有在待扩增区域与其相应模板重叠的至少15个核苷酸。PCR扩增中使用的聚合酶应具有高保真性例如聚合酶Stratagene，以减少PCR扩增过程中的序列错误。为了例如在构建融合多肽以及在随后将其插入克隆载体时易于将几条独立的PCR片段连接在一起，PCR引物还应在其旁侧末端具有独特且唯一的限制性消化位点，所述限制性消化位点在PCR扩增期间不与DNA模板发生退火。每对具体引物的限制性消化位点的选择应使得融合多肽的编码DNA序列在读码框中（in-frame，并能从头到尾编码所述融合多肽，而不含终止密码子。同时，在融合多肽的编码DNA序列中不应存在所选的限制性消化位点。可将目的多肽的编码DNA序列连接至克隆载体pBR322或其衍生物之一中，以进行扩增、对嵌合编码序列的保真度和真实性（authenticity进行验证、针对多肽中的特定氨基酸突变和替换进行替换和或特定定点突变。[0197]或者，可使用例如包含拓扑异构酶辅助的TA载体如Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA的克隆方法将多肽的编码DNA序列PCR克隆入载体。和均为定向TOPO入门载体entryvector，所述定向TOPO入门载体能够允许将DNA序列以5’—3’方向克隆入表达载体。5’—3’方向的定向克隆便于将DNA序列单向插入蛋白表达载体中，以使得启动子位于融合多肽的编码DNA序列的5’ATG起始密码子的上游，这使得启动子能够驱动蛋白表达。可将携带有融合多肽的编码DNA序列的重组载体转染至常用的克隆大肠杆菌如XLlBlue、SURE*STRATAGENE®和TOP-IO细胞Invitrogen中并在其中进行增殖。[0198]本领域技术人员能够使用特别设计的寡核苷酸探针和本领域所熟知的聚合酶链式反应PCR方法学，对感兴趣的抗原的编码区域与互补亲和分子的编码区域进行克隆和连接，以构建融合多肽的嵌合编码序列，所述融合多肽包含抗原或其片段以及互补亲和分子或其衍生物。本领域技术人员还能够将融合蛋白的嵌合编码序列克隆并连接入所选的载体中，例如细菌表达载体、昆虫表达载体或杆状病毒表达载体。抗原和靶抗原多肽或其片段的编码序列应以在读码框中的方式连接，并且所述嵌合编码序列应连接在启动子的下游、启动子和转录终止子之间。随后，将所述重组载体转染入常规的克隆大肠杆菌例如XLlBlue中。然后，通过抗生素抗性对怀有转化载体DNA的重组大肠杆菌进行筛选，以除去任何怀有非重组质粒DNA的大肠杆菌。使筛选出的转化子大肠杆菌进行生长，随后对重组载体DNA进行纯化，用于转染至草地贪夜蛾S.frugiperda细胞中。[0199]在一些实施方式中，本文所公开的抗原可包含用于转位至细菌周质空间的信号肽。所述信号肽也被称作N端前导肽，所述信号肽在转位过膜后可能被切除或可能不被切除。信号肽的一个实例为本文所公开的MKKIWLALAGLVLAFSASASEQIDN0:1。另一信号肽为MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRASEQIDN0:14。信号肽的其它实例可以在SPdb信号肽数据库，SignalPeptideDatabase中找到，所述数据库可在万维网网址“proline·bic·nus·edu·sgspdb’’找到。[0200]在一些实施方式中，当将所述抗原融合至互补亲和蛋白时，信号序列可位于所述互补亲和蛋白的N端。例如，如果将抗原融合至亲和素样蛋白，所述信号序列可位于所述互补亲和蛋白的N端。在一些实施方式中，在互补亲和蛋白与第一亲和分子缔合前，将所述信号序列从所述互补亲和蛋白上切除。[0201]在一些实施方式中，本文所述的抗原和或互补亲和蛋白缺少信号序列。[0202]本文所述的多肽可在多种表达宿主细胞中进行表达，所述宿主细胞例如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻类细胞如衣藻Chlamadomonas，或可在无细胞表达系统中进行表达。在一些实施方式中，可将核酸从克隆载体中亚克隆至重组表达载体，所述重组表达载体适于在细菌、哺乳动物、昆虫、酵母、或植物细胞、或无细胞表达系统（如兔网织红细胞rabbitreticulocyte表达系统）中表达融合多肽。一些载体被设计用于转移编码核酸以用于在单个重组反应onesinglerecombinationreaction中在哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母中进行表达。例如，一些GATEWAYliInvitrogen目的载体destinationvector被设计用于构建杆状病毒、腺病毒、腺相关病毒AAV、逆转录病毒和慢病毒（lentiviruses，当所述病毒感染其各自的宿主细胞时，允许融合多肽在合适的宿主细胞中进行异源表达。根据制造商的说明书，将基因转移入目的载体只需两步即可实现。已有用于在昆虫细胞、哺乳动物细胞和酵母中进行蛋白表达的GATEWAY"表达载体。在大肠杆菌中进行转化和筛选之后，表达载体已准备好用于在合适的宿主中表达。[0203]其它表达载体和宿主细胞的实例有：用于在哺乳动物细胞系（如CH0、C0S、HEK-293、Jurkat和MCF-7中进行表达的基于强CMV启动子的pcDNA3·1载体（Invitrogen和pCINEO载体Promega;用于在哺乳动物细胞中进行腺病毒介导的基因转移和表达的复制缺陷腺病毒载体pADEN0-X™、pAd5F35、pLP-ADENO™-X-CMVClONTECHk、pAdCMVV5-DEST、pAd-DEST载体Invitrogen;用于在哺乳动物细胞中进行逆转录病毒介导的基因转移和表达的用于与来自Clontech的RETR0-X™系统一起使用的pLNCX2、pLXSN和pLAPSN逆转录病毒载体;用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的PLentiVV5-DEST™、pLenti6V5-DEST™和pLenti6·2V5-GWlacZInvitrogen;用于在哺乳动物细胞中进行腺相关病毒介导的基因转移和表达的腺病毒相关病毒表达载体，例如PAAV-MCS、pAAV-IRES-hrGFP和pAAV-RC载体（Stratagene;用于在草地贪夜蛾9Sf9、Sfll、Tn-368和BTI-TN-5B4-1昆虫细胞系中进行表达的BACpak6杆状病毒（Clontech和pFASTBAC™HTInvitrogen;用于在果绳（DrosophilaSchneiderS2细胞中进行表达的pMTBiPV5_HisInvitrogen;用于在巴斯德毕赤酵母P.pastoris中进行表达的毕赤酵母Pichia表达载体pPICZa、pPICZ、pFLDa和pFLDInvitrogen，和用于在甲醇毕赤酵母（P.methanolica中进行表达的载体pMETa和pMET;用于在酵母酿酒酵母S.cerevisiae中进行表达的载体pYES2GS和pYDlInvitrogen。[0204]描述了在莱茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii中大规模表达异源蛋白的最新进展（61^68匕6〇11〇8病毒颗粒ml的高效价以及由进一步浓缩得到IOll-IO12病毒颗粒ml。转入的基因被整合进入宿主基因组中，因此表达是长期且稳定的。[0220]AAV载体的大规模制备通过对包装细胞系的三质粒共转染:将携带编码核酸的AAV载体、含有AAVrep和cap基因的AAVRC载体、以及腺病毒辅助质粒pDF6共转染入亚汇合的293细胞的50X150mm平板。转染三天后收获细胞，病毒通过三个冷冻-解冻循环或超声处理而释放。[0221]AAV载体可通过两种不同方法进行纯化，这取决于载体的血清型。基于AAV2载体对肝素的亲和性，通过一步重力流柱single-stepgravity-flowcolumn法对AAV2载体进行纯化。Auricchio等，12HumanGeneTher.712001年）；Summerford和Samulski，72了.¥化〇1.14381998年）；51111111^^€^1和5311111181^，5恥1]\^1.5871999年）。目前通过三个相继的CsCl梯度对AAV21和AAV25载体进行纯化。[0222]不期望受理论束缚，当蛋白被细胞（包括细菌细胞）表达时，将蛋白导向targetedto细胞中的特定部分或从细胞中分泌出。因此，蛋白导向或蛋白分选是一种机制，细胞通过该机制将细胞转运至细胞中的合适位置或细胞外。分选的目标可以是细胞器的内部空间、若干内膜的任何之一、细胞的外膜或经由分泌到达它的外部。这一递送过程基于蛋白本身所含的信息进行。正确的分选对细胞至关重要;错误可能导致疾病。[0223]有一些例外，细菌缺乏真核生物中存在的膜结合细胞器，但它们可将蛋白组装到各种类型的内含物例如气囊gasvesicles和储存颗粒）上。同时，根据细菌的种类，细菌可能具有单个质膜革兰氏阳性细菌）、或具有内（质膜和外细胞壁膜二者，并在这二者之间具有称为周质的含水空间革兰氏阴性细菌）。根据是否存在外膜，可将蛋白分泌至环境中。质膜处的基本机制与真核细胞类似。此外，细菌可导向蛋白进入或穿过外膜。分泌蛋白穿过细菌外膜的系统可能相当复杂，并在发病机制中发挥关键作用。这些系统可被描述为I型分泌、II型分泌等。[0224]在大多数革兰氏阳性细菌中，某些蛋白被导向穿出质膜，随后共价连接至细菌细胞壁。专门的酶分选酶sortase在蛋白C端附近的特征识别位点处例如LPXTG基序SEQIDN0:16其中X可以是任何氨基酸）对靶蛋白进行切割，然后将所述蛋白转移至细胞壁上。类似于分选酶LPXTG、具有PEP-CTERM基序（SEQIDNO:17、被称为外分选酶exosortasePEP-CTERM的系统已被提出存在于广泛的革兰氏阴性菌中。[0225]具有合适的N端靶向信号的蛋白在细胞质中合成，然后定向至特定的蛋白转运途径。在所述蛋白转位穿过细胞质膜期间或之后不久，将所述蛋白加工并折叠成其活性形式。然后，使转位的蛋白保留在细胞的周质侧，或释放进入环境中。由于将蛋白导向膜的信号肽是转运途径特异性的关键决定因素，因此，按照其将蛋白所定向的转运途径对这些信号肽进行分类。信号肽的分类基于信号肽酶SPase的类型，所述信号肽酶负责信号肽的移除。大多数输出的蛋白通过一般的“分泌Sec途径”从细胞质中运输出。大多数众所周知的由革兰氏阳性病原体分泌的毒力因子如金黄色葡萄球菌的外毒素、炭疽杆菌的保护性抗原、单核细胞增生李斯特氏菌的李斯特菌素（Iysteriolysin0具有典型的N端信号肽，所述N端信号肽会将它们导向Sec途径。经由这一途径分泌的蛋白以未折叠的状态转位穿过细胞质膜。这些蛋白的后续加工和折叠在膜另一侧的细胞壁环境中进行。除Sec系统夕卜，一些革兰氏阳性细菌还含有Tat系统，所述Tat系统能够将折叠的蛋白转位穿过膜。病原性细菌可能含有某些特殊目标输出系统，所述系统具体涉及少数几个蛋白的转运。例如，已在分枝杆菌中鉴定出几个基因簇，所述基因簇编码经由特定途径ESAT-6分泌到环境中的蛋白，所述蛋白对分枝杆菌发病机制很重要。特异的ATP结合盒ABC转运蛋白指导被称作细菌素（bacteriocins的小抗菌肽的输出及加工。负责细菌裂解启动的内溶素endolysins的基因通常位于编码类穴蛋白（holin-like的基因附近，这表明这些穴蛋白负责将内溶素输出至细胞壁。Wooldridge,BACT.SECRETEDPROTS:SECRETORYMECHS.ROLEINPATHOGENCaisterAcademicPress,2009〇[0226]在一些实施方式中，在本发明中有用的信号序列为OmpA信号序列，然而，涵盖本领域普通技术人员通常所知的允许将抗菌剂转运和分泌至噬菌体感染细胞外的任何信号序列，以用于本发明。[0227]指导蛋白从细菌细胞中分泌的信号序列为本领域所众所周知，例如在国际申请TO2005071088中所公开的信号序列。例如，可使用表5所示的信号肽非限制性实例中的一些，所述信号肽可连接至抗菌肽（Amp或抗菌多肽的氨基端或羧基端，以通过抗菌剂工程化的噬菌体（例如，AMP工程化噬菌体进行表达。连接可经由与所选的抗原或抗原-互补亲和分子融合蛋白进行融合或嵌合构成，以使其从感染有抗菌剂工程化的噬菌体例如AMP工程化噬菌体的细菌中分泌。[0228]表5指导细菌细胞的蛋白或肽抗原或抗原-互补亲和分子融合蛋白分泌的示例信号肽[0229][0230]本文所述的多肽，如抗原或抗原-互补亲和分子融合蛋白可通过本领域技术人员已知的各种方法进行表达和纯化，例如，本文所述的融合多肽可由任何合适的表达系统纯化而得。通过标准技术可将融合多肽纯化至基本上纯，所述技术包括使用如硫酸铵的物质进行选择性沉淀、柱色谱、免疫纯化法以及其它技术;这些技术在本领域中是公知的。参见例如Scopes，PR0TEINPURIFICATI0N:PRINCIPLESPRACTICE1982;美国专利号4,673，641〇[0231]纯化重组蛋白时可使用多种工序。例如，可将具有确定的分子粘附性质的蛋白质可逆地融合至所选择的蛋白。使用合适的配体，可将所述蛋白选择性地吸附至纯化柱，然后以相对纯的形式由所述柱释放。然后通过酶活性移除融合的蛋白。最后，可以使用亲和或免疫亲和柱对所选择的蛋白进行纯化。[0232]蛋白在宿主细胞中表达之后，可裂解所述宿主细胞以释放出所表达的蛋白来用于纯化。裂解多种宿主细胞方法记载于“SamplePreparation-ToolsforProteinResearch”EMDBioscience和CurrentProtocolsinProteinSciencesCPPS中。纯化方法的实例为亲和色谱，如使用镍、钴、或锌亲和树脂用于组氨酸标记的融合多肽的金属_离子亲和色谱。由Clontech使用其TALON%钴树脂、以及N0VAGEN®在其PET系统手册，第10版中对纯化组氨酸标记的重组蛋白的方法进行了描述。另一优选的纯化策略为免疫亲和色谱，例如，可将抗-myc抗体缀合的树脂用于亲和纯化myc-标记的融合多肽。当存在合适的蛋白酶识别序列时，可将融合多肽由组氨酸或myc标记处切断，由亲和树脂释放所述融合多肽，而将组氨酸标记和myc标记残留附着至所述亲和树脂。[0233]纯化重组蛋白和天然存在的蛋白的标准蛋白分离技术在本领域中是公知的，例如溶解度分级分离solubilityfractionation、尺寸排阻凝胶过滤以及各种柱色谱。[0234]溶解度分级分离:经常作为起始步骤，特别是当蛋白质混合物复杂时更是如此，初始的分级盐析可将许多不需要的宿主细胞蛋白（或者源自细胞培养基的蛋白）与感兴趣的蛋白分离。优选的盐为硫酸铵。硫酸铵通过有效地减少蛋白质混合物中水的量来使蛋白质沉淀。然后蛋白质基于其溶解度而沉淀。疏水性越强的蛋白越有可能在较低的硫酸铵浓度下沉淀。通常的流程包括将饱和硫酸铵添加至蛋白质溶液，使得所得的硫酸铵浓度为20%-30%。这一浓度将使最具疏水性的蛋白质沉淀。然后弃去沉淀除非感兴趣的蛋白质是疏水性蛋白质），并将硫酸铵加入至上清液，直至已知使感兴趣的蛋白质沉淀的浓度。然后将沉淀在缓冲液中溶解solubilized，如果有必要，通过透析或渗滤移除过量的盐。依赖于蛋白质溶解度的其它方法如冷乙醇沉淀是本领域技术人员公知的，并且可用于分级分离复杂的蛋白质混合物。[0235]尺寸排阻过滤:使用通过不同孔径膜例如AM丨CONkSMHHporeli膜）的超滤，可利用所选择的蛋白质的分子量以将其与更大或更小的蛋白质分离。首先，通过膜对蛋白质混合物进行超滤，所述膜具有截留分子量低于感兴趣蛋白质的分子量的孔径。随后将超滤的滞留物retentate通过具有截留分子量高于感兴趣蛋白质的分子量的孔径的膜进行超滤。重组蛋白将通过膜进入滤液。随后可如下述对滤液进行色谱分离。[0236]柱色谱:还可根据所选择的蛋白质的大小、净表面电荷、疏水性和配体亲和性将所选择的蛋白质与其它蛋白质分离。另外，可将针对重组蛋白或天然存在的蛋白产生的抗体缀合至柱基质并免疫纯化蛋白。全部这些方法在本领域中都是公知的。对本领域技术人员而言显而易见的是，色谱技术可在任何规模上实施，并可使用来自众多不同制造商（例如，PharmaciaBiotech的设备。例如，可使用PA63七聚物亲和柱对抗原多肽进行纯化。Singh等，269，J·Biol·Chem·290391994〇[0237]在一些实施方式中，可将包含例如：（a离子交换色谱、（b羟基磷灰石色谱、（c疏水相互作用色谱和d尺寸排阻色谱的纯化步骤的组合用于对本文所述的融合多肽进行纯化。[0238]还设想了无细胞表达系统。无细胞表达系统提供了若干优于传统的基于细胞的表达方法的优点，包括易于对反应条件进行修改以利于蛋白质折叠、降低对产品毒性的敏感度、以及由于降低了反应体积和处理时间而对高通量策略的适用性例如快速表达筛选或大量蛋白质生产）。无细胞表达系统可以使用质粒DNA或线性DNA。此外，翻译效率的改善已使得每毫升反应混合物的蛋白质产量高于1毫克。市售的无细胞表达系统包括TNT偶联网织红细胞裂解物系统Promega使用基于兔网织红细胞的体外系统）。[0239]免疫组合物的制剂及使用方法[0240]本发明的具体实施方式提供了本文所公开的免疫原性组合物在动物中引发免疫应答的用途。更具体而言，所述组合物既引发体液免疫又引发细胞免疫，并在许多情况下引发粘膜免疫。本发明的实施方式对于感染，特别是肺炎球菌感染提供了至少部分保护或在感染后提供了至少部分改善。肺炎球菌导致多种疾病，如脑膜炎、肺炎、菌血症bacteremia和中耳炎。全球每年都有近100万儿童死于肺炎球菌疾病。已对肺炎链球菌进行了广泛研究，并且基因组中的至少一些得以测序。参见例如美国专利号7，141，418。尽管针对定义了已知血清型的荚膜多糖的抗体赋予了血清型特异性的保护，然而其它免疫保护机制也已得以描述。参见Malley等，88J.Mol.Med.1352010。这些其它保护机制包括但不限于针对非荚膜抗原的抗体和针对肺炎球菌成分的T细胞应答。蛋白-多糖缀合疫苗PCV7的应用已显著减少了疾病。Black等，24S2Vaccine792006;Hansen等，25Pediatr·Infect·Dis·J·7792006。然而，最近的研究表明在PCV7中缺乏其它血清型导致了产生肺炎球菌血清型替换。PichicheroCasey，26SlOPediatr·Infect.Dis·J.S122007〇[0241]对于物种全部血清型而言的某些通用肺炎球菌抗原已显出具有潜在的免疫保护作用，而不论如何封装，例如表面蛋白PspA、PspC、PsaA和细胞毒素肺炎球菌溶血素或肺炎球菌溶血类毒素pneumolysoid突变体Basset等，75Infect.Tmmun.54602007；Briles等，18Vaccine17072000;基因组和突变文库的使用已识别了数十种额外的物种通用蛋白（HavaCamilli，45Mol.Microbiol·13892002;Wizemann等，60Infect.Tmmun.15932001。在动物模型中已由个别抗原诱发免疫（Alexander等，62Infect.Immun.56831994;Balachandran等，70Infect.Immun.25262002;Chung等，170J.Immunol.19582003;61〇¥61等，7611^6^.11111111111.27672008;数1等，175了.111^.018.8391997，但目前还没有用于人的基于通用抗原的疫苗获得批准。[0242]在一个实施方式中，本文提供了对哺乳动物进行接种的方法，所述方法包括给予免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有连接至至少一种类型的聚合物支架例如多糖或碳水化合物聚合物）的至少一种或多种抗原，以用于在给予受试者时引发针对连接至所述聚合物的所述一种或多种抗原的免疫应答。在一些实施方式中，所述免疫应答为体液免疫应答和或细胞免疫应答。[0243]因此，本发明的一方面涉及在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给予免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种类型的聚合物例如多糖）、至少一种抗原和至少一种互补亲和分子对，所述互补亲和分子对包含（i与所述聚合物例如多糖缔合的第一亲和分子；以及ii与所述抗原缔合的互补亲和分子，从而将所述抗原连接至所述聚合物例如多糖）（例如，所述第一亲和分子与所述互补亲和分子缔合，从而将所述抗原连接至所述聚合物例如多糖）。[0244]因此，本发明的一方面涉及同时引发针对多种抗原的体液免疫和或细胞免疫的方法，例如，给予受试者的免疫原性组合物包含含有至少1种、或至少2种或更多种，例如多种相同或不同抗原的聚合物。[0245]本发明的一方面涉及针对病原体对受试者例如鸟类或哺乳动物例如人类）进行免疫或接种的方法，所述方法包括给予本文所公开的免疫组合物，所述组合物包含至少一种衍生自一种或多种病原体的抗原。在一些实施方式中，受试者可同时针对至少1种、或至少2种、或至少2种、或至少3种、或至少5种、或至少10种、或至少15种、或至少约20种、或至少50种、或至少约100种、或超过100种不同病原体进行免疫，其中免疫原性组合物的聚合物连接有相应的不同抗原。[0246]在一些实施方式中，可向受试者给予本文所公开的若干种不同的免疫原性组合物，例如，可向受试者给予包含具有抗原或多种抗原例如抗原A、B、C和D等的聚合物的组合物，并向受试者给予包含具有不同抗原或不同抗原组例如抗原W、X、Y和Z等）的聚合物的组合物。或者，可向受试者给予包含具有抗原或多种抗原例如，抗原A、B、C和D等的聚合物A的组合物，并向受试者给予包含含有相同抗原组例如抗原A、B、C和D等或不同抗原组的聚合物B的组合物。设想本发明提供了以所期望的尽可能多的抗原对受试者进行免疫的方法，例如，使用本文所述的各种不同免疫原性复合物，使得以多达100种或更多的抗原进行免疫。[0247]在一个实施方式中，本文所述的免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。在另一个实施方式中，将本文所述的免疫原性组合物配制为疫苗或配制在疫苗中，用于给予鸟类、哺乳动物或人类。例如，可在Remington’sPharmaceuticalSciences2006，或IntroductiontoPharmaceuticalDosageForms第4版，LeaFebiger，Philadelphia，1985中找到合适的制剂。[0248]在一个实施方式中，本文所述的免疫原性组合物包含本身无毒且不具有治疗作用的药学上可接受的载体。所述载体的实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐、或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾potassiumhydrogenphosphate、氯化钠、锌盐、娃溶胶（colloidalsilica、三娃酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、以及聚乙二醇。对于全部给予而言，适于使用常规储库depot形式。此类形式包括例如:微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、吸入形式、鼻喷雾剂、舌下片和缓释制品。对于缓释组合物的实例而言，参见美国专利号3,773,919、3，887,699、EP58,481A、EP158,277A、加拿大专利号1176565;Sidman等，22Biopolymers5471983;1^即61'等，12〇16111.16311.981982。通常以每患者每次给予约0.111^1111至10〇11^ml的浓度配制蛋白质。[0249]在一个实施方式中，可将其它成分添加至疫苗制剂，所述其它成分包括抗氧化剂例如抗坏血酸）；低分子量少于约十个残基）多肽例如聚精氨酸或三肽）；蛋白质（例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白）；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮）；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸）；单糖、二糖及其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精）；螯合剂例如ΗΤΑ;以及糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇）。[0250]在一些实施方式中，本发明的MAPS免疫原组合物与至少一种佐剂共同给予。佐剂是加强针对抗原（同时给予的抗原）的免疫应答的非均相物质组aheterogeneousgroupofsubstances。在一些情况下，佐剂提高免疫应答，从而需要较少的疫苗。佐剂有助于使抗原（刺激特定的保护性免疫应答的物质）与免疫系统相接触，并影响所产生的免疫的类型和免疫应答的质量强度magnitude或持续时间）。佐剂还可降低某些抗原的毒性;并向一些疫苗成分提供溶解性。目前适用的增强针对抗原的免疫应答的几乎所有佐剂都是颗粒、或与抗原共同形成颗粒。在VACCINEDESIGN-SUBUNITADJUVANTAPPROACHPowellNewman主编，Plenum出版社，1995—书中，描述了许多已知佐剂的免疫活性以及化学特性。不形成颗粒的佐剂的类型，是作为免疫信号物质发挥作用的物质的组和在正常条件下由免疫系统形成的物质作为在给予微粒佐剂系统之后免疫激活的结果构成的组。[0251]用于免疫原性组合物和疫苗的佐剂在本领域中是公知的。实例包括但不限于:单甘酯和脂肪酸例如油酸单甘油酯、油酸和大豆油的混合物）；矿物盐，如氢氧化铝和磷酸铝或磷酸钙凝胶;基于表面活性剂和油乳液的制剂，例如MF59微流化洗涤剂稳定化的水包油乳液）、QS21纯化的皂苷（saponin、AS02[SBAS2]水包油乳液+MPL+QS-21、MPL-SE、MontanideISA-51和ISA-720稳定化的油包水乳液）；微粒佐剂，例如，病毒颗粒virosome纳入流感血凝素的单层脂质体囊泡）、AS04具有MPL的[SBAS4]铝盐）、ISC0MS皂苷类和脂质的结构化复合物）、聚丙交酯-共-乙交酯PLG;微生物衍生物天然的和合成的），例如，单磷酰脂厶10^、〇6切1_1草分枝杆菌1^1161细胞壁骨架）^6?[1^-529]合成酰化单糖）、Det〇X-PC、DC_Ch〇l能够自我组织为脂质体的脂样（Iipoidal免疫刺激物）、〇M-174脂质A衍生物）、CpG基序含有免疫刺激性CpG基序的合成寡核苷酸或其它DNA结构、修饰的LT和CT提供无毒佐剂作用的基因修饰细菌毒素）；内源性人免疫调节剂，例如hGM-CSF或hIL-12可作为蛋白质或编码质粒给予的细胞因子）、ImmudaptinC3d串联阵列）、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpGODN、Betafectin、明矾和MF59;以及惰性载体例如金颗粒）。其它佐剂在本领域是已知的，参见例如美国专利号6,890,540;美国专利公开号2005，0244420;PCTSE9701003。[0252]在一些实施方式中，佐剂为微粒，并可具有能缓慢生物降解的特征。必须注意确保佐剂不形成有毒代谢产物。优选地，在一些实施方式中，所述佐剂可做基质matrices使用，且主要为来源于机体的物质。这些物质包括低毒性的生物相容性聚合物、乳酸聚合物、聚氨基酸蛋白质）、碳水化合物、和脂质。也可使用来自机体的这些物质组的组合或来自机体的物质和生物相容性聚合物的组合。由于脂质呈现出使其可生物降解的结构以及脂质在所有生物膜中均为关键元素这一事实，因此脂质是优选的物质。[0253]在一个实施方式中，必须将用于给药的本文所述的免疫原性组合物无菌地给予受试者。无菌性可通过无菌过滤膜例如〇.2微米膜过滤或通过伽玛辐射而容易地完成。[0254]在一些实施方式中，本文所述的免疫原性组合物进一步包含药物赋形剂，所述赋形剂包括但不限于:生物相容的油、生理盐水溶液、防腐剂、碳水化合物、蛋白质、氨基酸、渗透压控制剂、载气、pH控制剂、有机溶剂、疏水剂、酶抑制剂、吸水性聚合物、表面活性剂、吸收促进剂和抗氧化剂。碳水化合物的代表性实例包括可溶性糖，如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧基纤维素钠、透明质酸、壳聚糖、海藻酸盐酯、葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、硫酸软骨素等。蛋白质的代表性实例包括白蛋白、明胶等。氨基酸的代表性实例包括甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和它们的盐。此类药物赋形剂在本领域中是已知的。[0255]在一些实施方式中，免疫原性MAPS组合物与其它治疗成分联合给药，所述其它治疗成分包括例如：γ-干扰素、细胞因子、化疗剂或抗炎剂、或抗病毒剂。在一些实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物可以与一种或多种本文所公开的共刺激分子和或佐剂共同给药。[0256]在一些实施方式中，以纯的形式、或基本上纯的形式给予免疫原性组合物，但是也可以作为药物组合物、制剂或制品给予。此类制剂包含本文所述的MAPS和一种或多种药学上可接受的载体，以及任选的其它治疗成分。其它治疗成分包括增强抗原提呈的化合物，例如γ-干扰素、细胞因子、化疗剂或抗炎剂。所述制剂可方便地以单位剂型呈现，并可由制药领域中公知的方法制备。例如，Plotkin和Mortimer在Vaccines第二版，W.B.SaundersCo.，1994中描述了向动物或人类接种，以诱导对于特定病原体具有特异性的免疫应答，以及制备抗原、确定抗原合适剂量和分析免疫应答的诱导的方法。[0257]适合于静脉内、肌内、鼻内、口腔、舌下、阴道、直肠、皮下或腹腔内给药的制剂便利地包含活性成分的无菌水溶液，优选使用与接受者血液等渗的溶液。此类制剂可便利地通过下列方法制备：将固体活性成分溶解在含有生理相容物质（如氯化钠（例如〇.IM-2.0M、甘氨酸等）、并具有与生理条件相容的缓冲pH值的水中，产生水溶液，并对所述溶液进行除菌。这些制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器例如密封的安瓿或小瓶中。[0258]还可将脂质体悬浮液用作药学上可接受的载体。可根据本领域技术人员已知的方法例如美国专利号4，522，811中所述的方法制备所述脂质体悬浮液。[0259]在美国专利号5，427，782;5，843，451;6，398，774中描述了用于鼻内递送的制剂。[0260]免疫原性组合物的制剂中可引入稳定剂。说明性的稳定剂为聚乙二醇、蛋白质、糖类、氨基酸、无机酸和有机酸，所述稳定剂可单独使用或以混合物使用。可将两种以上稳定剂以适当浓度和或pH值用于水溶液中。该水溶液中特定的渗透压一般在0.1-3.0渗透单位osmoses的范围内，优选在0.80-1.2渗透单位的范围内。将水溶液的pH值调解至pH5.0-9.0的范围内，优选为pH6-8的范围内。[0261]当期望口服制品时，可将免疫原性组合物与常规载体相结合，如乳糖、蔗糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸镁、结晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、甘油、海藻酸钠或阿拉伯月父等。[0262]在一些实施方式中，可以静脉内、鼻内、肌内、皮下、腹腔内、舌下、阴道、直肠或口服给予本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方式中，给药途径为口腔、鼻内、皮下或肌内给药。在一些实施方式中，给药途径为鼻内给药。[0263]可通过常规方法进行接种。例如，可以在合适的稀释剂如盐水或水，或完全的或不完全的佐剂）中使用免疫原性组合物。可以通过任何适于引发免疫应答的途径给予免疫原性组合物。可一次给予免疫原性组合物，或以定期间隔给予直至引发免疫应答。可通过本领域技术人员已知的各种方法对免疫应答进行检测，包括但不限于:抗体产生、细胞毒性分析、增殖分析和细胞因子释放分析。例如，可以由免疫的哺乳动物抽取血样，并通过ELISA对针对免疫原性组合物的抗原的抗体的存在进行分析（参见deBoer等，115ArchVirol.1471990，并通过本领域已知的方法对这些抗体的效价进行测定。[0264]制剂中所使用的精确剂量还依赖于给药途径，并应根据执业医生的判断和每一患者的情况而决定。例如，可每月给予25yg-900yg总蛋白，给药三个月。[0265]最终，主诊医师将决定向特定个体给予免疫原性组合物或疫苗组合物的量。对于所有免疫原性组合物或疫苗而言，免疫原的免疫有效量必须根据经验确定。需要考虑的因素包括:免疫原性、免疫原是否与佐剂或载体蛋白或其它载体相复合或共价连接至佐剂或载体蛋白或其它载体、给药途径和待给予的免疫剂量的量。此类因素在疫苗领域中是已知的，并且免疫学家有充足能力作出此类决定而无需过度实验。[0266]试剂盒[0267]本发明还提供用于产生本文所公开的免疫原性组合物的试剂盒，所述试剂盒对于研究员定制具有其优选的抗原的免疫原性组合物例如为了研究目的而对抗原或抗原组合对免疫应答的影响进行评估是有用的。此类试剂盒可以由容易获得的材料和试剂制备。例如，此类试剂盒可包含下列材料中的任何一种或多种:包含聚合物例如多糖）的容器，所述聚合物与多个第一亲和分子交联;包含与所述第一亲和分子缔合的互补亲和分子的容器，其中，所述互补亲和分子与抗原缔合。[0268]在另一个实施方式中，所述试剂盒可包含:包含聚合物（例如多糖）的容器、包含多个第一亲和分子的容器、以及包含用于将所述第一亲和分子交联至所述聚合物的交联剂的容器。[0269]在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含将所述互补亲和分子连接至所述抗原的手段，其中所述手段可为通过交联剂或通过一些中间融合蛋白。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含至少一种共刺激因子，可将所述共刺激因子添加至所述聚合物。在一些实施方式中，所述试剂盒包含用于将所述共刺激因子连接至所述聚合物的交联剂，所述交联剂例如但不限于:CDAP1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐）、EDC1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）、氰基硼氢化钠;溴化氰；碳酸氢铵碘乙酸。[0270]根据试剂盒的预期用途、特定的靶抗原以及使用者的需要，可以制备各种试剂盒和组分以用于本文所述的方法中。[0271]在一个实施方式中，当将本文所述的免疫原性组合物或疫苗组合物给予小鼠时，可在由5LD5Q免疫原性组合物激发的动物的至少20%中引起防止疾病症状的免疫应答，所述免疫原性组合物包含所防止的疾病症状所针对的抗原。接种和激发免疫动物的方法在本领域中是已知的。例如，可在1〇〇μ1的I3BS和或添加的不完全弗氏佐剂中制备IOyg等份的本文所公开的免疫原性组合物或疫苗组合物，并且对于每一小鼠的每一接种通过肌内注射进行。或者，可以使用胃肠外、腹腔内和足垫footpad注射。足垫注射的量减少至50μ1。小鼠可由本文所公开的免疫原性组合物或疫苗组合物进行免疫，间隔若干天例如间隔14天分别进行三次。[0272]可通过病原体激发对接种效力进行测试。在最后一次免疫原性组合物给药七天后，用衍生抗原的病原性生物体通过鼻内对免疫的小鼠进行激发。可用50μ1含有5LD5Q病原性生物体的PBS稀释尿囊液通过鼻内给药感染乙醚麻醉的小鼠（IOg至12g。可通过监测动物存活和体重对保护作用进行测量，在21天的观察期中对所述保护作用进行评估。将严重受影响的小鼠执行安乐死。一个LD5〇AMallardPennsyIvania1021884等价于100-1000组织培养感染剂量50TCID50试验。[0273]在其它实施方式中，可使用各种不同的病原性生物体对免疫的小鼠进行激发，所述病原性生物体例如为衍生出连接至聚合物的各抗原的不同的病原性生物体。例如，对于含有连接至聚合物例如，多糖的5种不同抗原的免疫原性组合物，其中每一抗原衍生自5种不同的病原性生物体，可使用5种不同病原性生物体的每一种顺序地（以任何顺序）或同时地对免疫小鼠进行激发。本领域技术人员能够通过本领域已知的方法确定用于激发免疫小鼠的各病原性生物体的LD5Q。参见例如LaBarreLowy，96J.Virol.Meths.1072001;Golub，59J.Immunol.71948。[0274]尽管为了清楚理解的目的以说明和举例的方式对前面的发明进行了相当详细的描述，对本领域普通技术人员而言显而易见的是，可在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，根据本发明的教导对其作出某些改变和修饰。下面是为了说明本发明，然而，本发明的实践不以任何方式受实施例的限定或限制。[0275]实施例[0276]本文中所示的实施例涉及生成本文所述的免疫原性复合物的方法、及其方法和组合物。具体而言，实施例涉及生产本文所公开的多抗原提呈MAP复合物的方法、以及用于在受试者中产生免疫应答的方法。[0277]实施例1重组Rhizavidin和Rhizavidin-抗原融合蛋白的构建[0278]在这些研究中使用的重组RhizavidinrRhavi是N端修饰变体，所述N端修饰变体仅包含野生型蛋白第45-179位的残基。为了优化rRhavi在大肠杆菌中的表达水平，使用大肠杆菌偏好表达密码子对编码Rhizavidin多肽45-179的基因序列进行了重新设计，然后合成并克隆进PET21b载体中。为了有助于正确折叠和获得高产量的可溶性重组蛋白，将编码大肠杆菌周质定位信号序列（19个氨基酸，MKKIWLALAGLVLAFSASA，SEQIDNO:1的DNA序列引入合成的rRhavi基因的5’端。在表达过程中，预计这一信号序列在重组蛋白导向至大肠杆菌周质后被自动从所述重组蛋白中删除。[0279]为了构建Rhizavidin-抗原融合蛋白，将编码柔性接头区域（由七个氨基酸GGGGSSS，SEQIDN0:27组成）的DNA序列直接插入到合成的rRhavi基因的3’末端，以帮助稳定所述融合蛋白。通过常规PCR程序，将编码候选抗原全长或所需片段）的基因从感兴趣的病原体的基因组DNA中扩增出来，并仅越过接头区域插入至rRhavi表达载体中。[0280]关于蛋白表达，使用标准热休克程序将含有目标构建体的质粒转染到大肠杆菌菌株BL21DE3中。从平板中（或之后使用甘油储液）中挑取新鲜的单菌落，并将其接种至30ml含有氨苄青霉素Amp+的Luria-BertaniLB培养基中，在37°C过夜培养。第二天，将5ml初始培养液接种至1升的LB培养基Amp+中，在37°C生长直至达到OD6qq=U将培养基冷却至16°C后，将终浓度为0.2mM的IPTG添加至培养液中过夜诱导。[0281]使用改进的渗透冲击osmoticshock方案将蛋白从周质部分中纯化出来。简单地说，收集来自6升培养液中的细菌细胞并将其重悬于120ml含有30mMTrispH8.0、20%蔗糖和ImMEDTA的缓冲液中。在室温下搅拌20分钟后，通过在10,000rpm下离心10分钟，使所述细胞重新沉淀。收集上清液作为部分1，并将所述细胞重悬于80ml含有5mMMgCl2、蛋白酶抑制剂和DNase的冰冷溶液中。在4°C搅拌20分钟后，使所述混合物在13，OOOrpm下离心20分钟，并收集上清液作为部分2。加入终浓度为150mMNaCl、10mMMgCl2和IOmM咪唑之后，将混合了部分1和部分2的上清液施加于Ni-NTA柱上。使用在AKTA纯化器上运行的superdex200柱，通过凝胶过滤对从Ni-NTA柱上洗脱下来的蛋白进行进一步纯化。将含有目标蛋白的峰部分合并并浓缩。使用来自Bio-Rad的BCA蛋白测定试剂盒对蛋白浓度进行测量。将纯化的蛋白质分为小份，在液氮中速冻并在-80°C保存以供将来使用。[0282]实施例2多糖的生物素化[0283]多糖的生物素化使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐CDAP作为活化试剂进行。简单地说，将多糖以l〇mgml或所指定的其它浓度溶于不含LPS的水中。在t=0时，将一定体积的CDAP在乙腈中新制得的，100mgml以l-2mgCDAPmg多糖的比例缓慢加入多糖溶液中，同时进行涡旋。三十秒之后，加入一定体积的〇.2M三乙胺TEA与⑶PA相等体积或两倍体积，这取决于多糖的不同类型），以提高pH。在2.5分钟时，加入一定体积的生物素衍生物来自Pierce的EZ-Link胺-PEG3-生物素，以20mgml溶解于不含LPS的水中）至最终比例为l-1.5mg生物素mg多糖，在4°C过夜偶联或在25°C偶联卜3小时）。在第2天，加入终浓度为50mM的甘氨酸或丝氨酸以终止反应，然后使混合物过柱进行脱盐或用大体积PBS进行透析，以移除游离的生物素衍生物。使用来自Pierce的生物素定量试剂盒，对生物素化多糖中的生物素含量进行测量，并通过蒽酮试验对多糖浓度进行测定。[0284]实施例3MAPS的组装和纯化[0285]为了组装MAPS复合物，将一定体积的生物素化多糖与候选rRhavi-抗原融合蛋白以所需比例进行混合，然后将其在4°C或25°C孵育过夜。孵育后，将所述混合物在13，200rpm下离心3分钟，以除去不溶性聚集体。将上清液施加至凝胶过滤色谱，使用superpose-6或sperdex-200柱，以PBS、Tris缓冲液或盐水作为运行溶液。对含有大分子量复合物的峰部分进行收集和浓缩。通过SDS-PAGE，用考马斯蓝染色对蛋白含量以及MAPS复合物中不同抗原的比例进行检测，并使用BCA蛋白测定试剂盒和蒽酮试验对MAPS的蛋白多糖比例进行测定。[0286]实施例4免疫、抗体和细胞因子分析、激发小鼠[0287]在免疫前一天制备所有免疫原性组合物和疫苗。用盐水将肺炎球菌全细胞疫苗、MAPS或等摩尔混合物含有所有特定抗原、rhizavidin、多糖和生物素稀释至指定浓度，然后在15ml锥形管中与AlOH3混合，在4°C吸附过夜。[0288]在所有免疫实验中使用C57BL6J小鼠（JacksonLaboratories，BarHarbor，Maine。首次免疫时为4-6周龄。使轻微受约束、未麻醉的小鼠在背部的较下部位，以两周的间隔接受3次皮下注射注射含有或不含有指定量抗原的200μ1佐剂）。在第二次和或第三次免疫后的两周，抽取血液，并在用肺炎球菌全细胞抗原WCA、ΤΒ提取物或特定蛋白抗原刺激后，对体外细胞因子和抗体的产生进行分析。[0289]在最后一次免疫或采血后的2周进行激发。在NP定殖模型中，用处于20μ1PBS中的菌落形成单位CFU为2XIO7的血清型6Β菌株0603对小鼠进行鼻内激发。为了对NP定殖的存在和程度进行测定，在10天后，通过经横断气管transectedtrachea逆行滴注无菌盐水进行上呼吸道培养，从鼻孔收集前6滴约0.1ml，将未经稀释的样品或稀释样品铺于含有2.5yg庆大霉素ml的血琼脂板上。[0290]在吸入性脓毒症激发模型中，用异氟烷isoflorane将小鼠平缓麻醉、保持仰卧supine、并给予ΙΟΟμΙ含有IO6CFU肺炎球菌血清型3菌株WU-2的鼻内接种。每日对小鼠进行两次监测，并在证明疾病症状时，通过CO2吸入和末端放血而处死，之后获得血培养物。[0291]在涂覆有WCAIOOyg蛋白mlI3BS或蛋白抗原（Iyg蛋白mlPBS的Immulon2HB96微孔板ThermoScientific，Waltham，MA中进行针对WCA或不同蛋白抗原的鼠源抗体分析。用处于PBS中的1%BSA对板进行封闭。加入在PBS-T中稀释的抗体，并在室温下孵育2小时。将板用PBS-T清洗，然后加入抗小鼠免疫球蛋白G的HRP缀合第二抗体来自Sigma，并在室温下孵育1小时。将板进行清洗并用SureBlueTMBMicrowellPeroxidaseSubstrateKPL，Gaithersburg，MD显影。[0292]关于细胞因子刺激，将刺激物在刺激介质DMEMBioWhittaker，Walkersville，MD中稀释至所有蛋白抗原或肺炎球菌WCA的浓度为lygml-10ygml，所述刺激介质含有10%低内毒素限定FBSHyclone，Logan，UT、50μΜ2_疏基乙醇（Sigma和环丙沙星（IOygml，CelIgro，Manassas，VA。将25μ1肝素化血液添加至225μ1的含有或不含有刺激物的DMEM介质中，并在37°C培养6天。将上清液收集，然后进行离心，并将其储存在-80°C，直至通过ELISA对IL-17A或IFN-γ的浓度进行分析RDSystems，Minneapolis，MN。[0293]关于对脾细胞的刺激，将小鼠脾细胞分离，重悬于刺激介质中，然后接种至48孔板3XIO6细胞孔，体积为300μ1。在37°C孵育2小时后，将刺激物以指定浓度加入，以在37°C刺激3天。将上清液收集，然后离心，并将其储存在-80°C，直至通过ELISA对IL-17A或IFN-γ的浓度进行分析。[0294]使用PRISMMacintosh4.Oa版本，GraphPadSoftware，Inc，通过Mann-WhitneyU检验对抗体和IL-17A的浓度以及NP定殖密度进行比较。同样使用PRISM，以Kaplan-Meier检验对存活差异进行分析。

权利要求：1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含聚合物、至少一种抗原以及至少一种互补亲和分子对，所述互补亲和分子对包含：与所述聚合物缔合的第一亲和分子;和与所述抗原缔合的互补亲和分子，其中，所述第一亲和分子与所述互补亲和分子缔合，从而连接所述抗原和所述聚合物。

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