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申请/专利权人：新疆农业大学

摘要：本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种棉花中同时实现基因沉默和基因编辑的方法。本发明基于CLCrV和TRV介导的在棉花中同时实现基因沉默和基因编辑技术体系的建立，为后期沉默GhWUS基因表达并借助VIGE系统获得可遗传的基因编辑提供了重要的技术工具。TRV和CLCrV作为VIGS载体使用时，基因沉默效率会随着外源片段长度的增加而沉默效果越好，沉默表型也逐渐增强，但当外源片段长度超过1000bp时，完全没有沉默表型。此外，以这两种植物病毒作为VIGE载体时也会受到病毒自身承载力的限制，随着沉默片段的增长，可能会降低sgRNA在棉花体内系统的表达，导致基因编辑效率降低。

主权项：1.一种棉花中同时实现基因沉默和基因编辑的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取Cas9-OE棉花种子在ddH2O中浸泡，种子发芽后将幼苗移栽，生长15d，选取Cas9-OE子叶完全展开的幼苗备用；S2、以S1中选取Cas9-OE子叶的cDNA为模板，克隆GhCLA1基因沉默片段，基于CLCrV和TRV病毒载体分别构建靶向敲除GhCLA1基因的CLCrV-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA载体以及沉默GhCLA1基因的TRV:GhCLA1载体；通过酶切分别将GhCLA1沉默片段和敲除GhCLA1以及GhAGL16的sgRNA串联组装在TRV-V2和CLCrV-A载体中，生成CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA、TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA、CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA和TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA；S3、将TRV:GhCLA1、TRV-V1、TRV-V2空载体、TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA、TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA、CLCrV-B、CLCrV-A空载体、CLCrV-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA、CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA和CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA农杆菌分别划线培养，经活化后制备成转化液；将CLCrV-B分别与CLCrV-A空载体、CLCrV-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA、CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA和CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA农杆菌转化液等比例混合，得到混合液1～4；将TRV-V1分别与TRV-V2空载体、TRV:GhCLA1、TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA和TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA农杆菌转化液等比例混合，得到混合液5～8；混合液1～8于室温下静置3h，将CLCrV-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA混合液和TRV:GhCLA1混合液分别接种同一Cas9-OE植株的两片子叶，作为group1；将CLCrV-A空载体混合液和TRV:GhCLA1混合液分别接种同一Cas9-OE植株的两片子叶，作为group2；将CLCrV-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA混合液和TRV-V2空载体混合液分别接种同一Cas9-OE植株的两片子叶，作为group3；将CLCrV-A空载体混合液和TRV-V2空载体混合液分别接种同一Cas9-OE植株的两片子叶，作为group4；将TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA混合液、CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA混合液、TRV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA混合液和CLCrV:GhCLA1-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA混合液分别接种同一Cas9-OE植株的两片子叶，作为group5～8；S4、接种不同组合病毒载体15～20d后，提取S3中接种不同混合液后Cas9-OE植株子叶的RNA，并反转成cDNA，qPCR扩增GhCLA1基因片段，以GhUBQ7内参基因为对照，设置3次重复；S5、分别从接种group1、group3以及group5～8的Cas9-OE棉花子叶和系统叶片中提取基因组DNA，均匀取接种相同病毒载体植株基因组DNA混样，得到混样基因组DNA，以混样基因组DNA为模板，利用PCRRE的方法对GhCLA1和GhAGL16基因进行突变检测；未被消化的PCR产物与BluntZero克隆载体连接，挑取若干单克隆测序，检测GhCLA1和GhAGL16基因目标位点的突变情况，并在接种group1病毒载体植株的系统叶片中检测CLCrV-B和TRV-V2病毒积累量；S6、通过PCRRE对每一株接种group5～8病毒载体检测到GhCLA1基因沉默的植株进行突变检测，同时，根据在未处理Cas9-OE植株中实际克隆的GhCLA1和GhAGL16基因组序列，设计高通量测序引物，统计分析GhCLA1和GhAGL16突变单株的真实编辑效率；S7、在Cas9-OE棉花中克隆长度为282bp和368bp的GhCLA1基因沉默片段，并基于TRV和CLCrV构建相对应的同时沉默和敲除GhCLA1的病毒载体：TRV:GhCLA1282bp-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA、TRV:GhCLA1368bp-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA、CLCrV:GhCLA1282bp-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA和CLCrV:GhCLA1368bp-AtU6-26::GhCLA1-sgRNA，依次命名为group9～12；将以上病毒载体分别接种Cas9-OE植株，并对接种植株中的GhCLA1基因沉默和编辑效率进行检测；S8、统计分析。

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