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申请/专利权人：广州市第一人民医院(广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院);四川艾能捷新材料科技有限公司

摘要：本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，提供了一种地锦草来源细胞外囊泡分离提取方法与应用，将新鲜地锦草根茎清洗干净，用双蒸水冲洗，沥干表面水分后剪碎，然后经过研磨处理，弃去滤渣，收集滤液，滤液中加入等体积磷酸盐缓冲液，将步骤一中的汁液在4℃下3500xg离心10—15min；弃去沉淀，取上清液，在4℃下10000xg离心20—30min，收集上清液，将步骤二中的上清液通过40μm的细胞筛网进行过滤，去除微米级别大颗粒；本发明采用的提取和分离技术采用一步低速离心结合300kDa超滤浓缩即可实现对地锦草细胞外囊泡的粗提取，使得细胞外囊泡在较少离心次数、较低转速和一步超高速离心操作下即可得沉淀，简化和优化了胞外囊泡的制备过程，适合工业大规模生产。

主权项：1.一种地锦草来源细胞外囊泡分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将新鲜地锦草根茎清洗干净，用双蒸水冲洗，沥干表面水分后剪碎，然后经过研磨处理，弃去滤渣，收集滤液，滤液中加入等体积磷酸盐缓冲液；步骤二：将步骤一中的汁液在4℃下3500xg离心10—15min；弃去沉淀，取上清液，在4℃下10000xg离心20—30min，收集上清液；步骤三：将步骤二中的上清液通过40μm的细胞筛网进行过滤，去除微米级别大颗粒，得到上清液；步骤四：吸取15ml步骤三中的精上清液转移至Vivaspin2超滤管300kDaMWCO中，在4℃下3500xg离心10—20min进行浓缩，得到粗地锦草细胞外囊泡浓缩液；步骤五：将步骤四中所述浓缩液置于固定角转子中，4℃下100000xg离心20—30min，随后弃去上清液，用5ml磷酸盐缓冲液重悬沉淀，随后过0.22μm的滤膜，得到悬液；步骤六：将收集的悬液从顶部加入从下而上依次装有60wt％、45wt％、30wt％碘化乙二醇溶液的超速离心管中，再在碘化乙二醇溶液最上层加入步骤五中所得的沉淀悬液，然后在4℃下140000xg超速离心60—90min；步骤七：离心结束后得到三层分层溶液和沉淀，弃去沉淀，吸取中间分层部分的溶液置入50ml离心管中，加入适量磷酸盐缓冲溶液混合均匀，在4℃下150000g继续超速离心60—90min除去碘化乙二醇溶液，得到的沉淀用1ml磷酸盐缓冲液重悬，后用0.22μm的滤膜进行过滤，即得到地锦草细胞外囊泡；步骤八：获得的滤液中加入13体积2wt％的硫酸葡萄糖胺溶液作为细胞外囊泡的保护剂，随后进行真空冷冻干燥，即可得到以冻干形式保存的地锦草细胞外囊泡。

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