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申请/专利权人：烟台大学

摘要：本发明公开了乌拉尔甘草黄酮类化合物glyasperinD的分离方法及其应用。分离方法：提取、QuikSeP中压色谱粗分、富含黄酮类成分的组分筛选、反相制备柱制备、Fr84的反相制备液相色谱纯化、黄酮类单体化合物glyasperinD抗非酒精性脂肪肝的活性评价六个步骤。本发明的乌拉尔甘草黄酮类化合物glyasperinD首次分离得到，并且分离方法成本低廉、产品纯度大于95%；本发明采用的技术手段可进行规模化生产：原料要求不高、成本低廉，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作；易于规模化。使用600μM油酸诱导的人肝L02细胞模型对单体化合物进行活性评价，显示本发明的黄酮类化合物glyasperinD具有显著的抗非酒精性脂肪肝的活性，能够制备抗非酒精性脂肪肝药物。

主权项：1.乌拉尔甘草黄酮类化合物glyasperinD的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1，提取：将乌拉尔甘草根阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次2～4h，过滤、合并滤液，即滤液A，按照质量比，滤液A按硅胶的量：乌拉尔甘草药材的量＝1:5拌样并减压干燥，即得乌拉尔甘草提取物拌样样品；步骤2，QuikSeP中压色谱柱粗分：将乌拉尔甘草提取物拌样样品经装有QuikSeP固定相的中压色谱塔分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中的色谱峰馏分，经减压干燥即得目标组分Fr1～Fr9；其中，QuikSeP中压色谱柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径49mm，固定相为QuikSeP，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0～540min，0～100％B，540～690min，100％B，进样量为40.05g，流速为40mLmin；步骤3，富含黄酮类成分的组分筛选：在目标组分Fr1～Fr9及甘草黄酮C标准品中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mgmL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B、C、D、E、F、G、H、I、J、K，其中，滤液C为甘草黄酮C标准品溶液；取滤液B、C、D、E、F、G、H、I、J、K，利用液相色谱筛选乌拉尔甘草中富集有目标黄酮类成分的组分；其中，高效液相色谱仪采用的流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0～45min，0～100％B，45～60min，100％B，流动相流速为1.0mLmin；步骤4，反相制备柱制备：选取滤液I经反相色谱柱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr81～Fr87，经减压干燥得到目标化合物组分Fr84；其中，反相制备柱制备的工作参数为制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为7μm的7-X10，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0～90min，45～57％B，90-100min，57％B洗脱，进样量203.0mg，流速为19mLmin；步骤5，目标化合物组分Fr84反相制备液相色谱纯化：目标化合物的组分Fr84用体积分数为0～10％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mgmL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液L；滤液L经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液L制备色谱图中的色谱峰馏分Fr841-Fr844，Fr844经减压干燥即得纯度大于95％的黄酮类化合物glyasperinD；其中，目标化合物组分Fr84反相制备液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的C18Amide柱，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0-90min，60％B洗脱，进样量145.0mg，流速为19mLmin。

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