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申请/专利权人：北京五加和基因科技有限公司

摘要：本发明涉及免疫检测领域，更具体地，本发明涉及体外对来自昆虫杆状病毒载体生产系统的样品测定杆状病毒蛋白例如，AcMNPVGP64蛋白残留量的方法以及用于实施该测定方法的试剂盒。

主权项：1.对来自昆虫杆状病毒载体生产系统的rAAV样品测定杆状病毒蛋白残留量的方法，所述昆虫杆状病毒载体生产系统中使用的昆虫细胞是Sf9细胞，杆状病毒是AcMNPV，包括如下步骤：1准备来自昆虫杆状病毒载体生产系统的待检rAAV样品、标准品和阴性对照，并准备第一抗体，所述第一抗体为针对真核细胞表达的AcMNPVGP64蛋白的多克隆抗体，是通过使用真核细胞表达的AcMNPVGP64蛋白作为免疫原免疫兔制备的；其中所述标准品为系列稀释的浓度范围在80至5ngmL的真核细胞表达的AcMNPVGP64蛋白；所述阴性对照为Sf9细胞总蛋白，检测并获得待检rAAV样品中的残余Sf9宿主细胞总蛋白含量，系列稀释阴性对照，将检测不到1:500至1:1000稀释的第一抗体与阴性对照稀释物结合时的阴性对照Sf9蛋白最高浓度与检测到的待检rAAV样品中的残余Sf9宿主细胞总蛋白含量浓度比较，如果前者大于后者，则无需稀释待检rAAV样品；如果前者小于后者，则稀释待检rAAV样品，使得前者大于稀释后的待检rAAV样品残余Sf9宿主细胞总蛋白含量浓度；2将步骤1的经稀释待检rAAV样品或无需稀释的待检rAAV样品、标准品和阴性对照分别进行系列稀释，加样2-4ul至硝酸纤维素膜或PVDF膜上，风干；3以1×TBST为溶液配制含5％－10％wv脱脂奶的封闭液，将点样后风干的硝酸纤维素膜或PVDF浸泡在该封闭液中，封闭1－3小时；4使第一抗体分别与承载于膜上的待检rAAV样品、标准品和阴性对照结合；孵育，洗膜，然后再加入1:3000至1:6000稀释的带有标记的抗兔第二抗体，孵育，洗膜；5显影并进行灰度扫描；6根据标准品的各稀释度所对应的灰度值，进行四参数Logistic曲线拟合，获得拟合方程；将待检rAAV样品的各稀释度所对应的灰度值与标准品的灰度值进行比较，将落入标准品显色灰度值范围内的待检rAAV样品稀释度所对应的灰度值确定为有效灰度值；将一个或多个有效灰度值代入拟合方程，获得一个或多个有效灰度值对应的待检rAAV样品稀释度下的残余GP64蛋白浓度，由此计算出待检rAAV样品中杆状病毒AcMNPVGP64蛋白残留量。

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