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申请/专利权人：中国科学院上海药物研究所

摘要：本发明涉及一种合成胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸活化的糖核苷酸的方法，其中，所述胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸活化的糖核苷酸由下式I表示。所述方法包括：通过从头生物合成途径或者补救生物合成途径，在辅因子再生系统的存在下，利用系统酶催化反应得到胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸dTDP活化的糖核苷酸。所述方法可以大规模、高效地制备dTDP活化的糖核苷酸，而且无需繁琐的纯化操作，因此具有成本低廉、适应性强的特点。

主权项：1.一种制备由下式I表示的胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸dTDP活化的糖核苷酸的方法， 在式I中，R2选自OH、H、AcNH，R4和R5各自独立地为OH、NH2或AcNH，R6选自CH2OH、COOH、CH3、H，dTDP表示胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸基， 表示不限定构型的化学键，所述方法包括：通过从头生物合成途径或者补救生物合成途径，在辅因子再生系统的存在下，利用系统酶催化反应得到所述胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸dTDP活化的糖核苷酸，其中，在所述从头生物合成途径中，胸腺嘧啶脱氧核苷在胸苷激酶TDK、dTMP激酶TMK和dTDP激酶NDK以及辅因子再生系统CRS1共同存在下发生酶催化反应得到胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸dTTP，再加入蔗糖、蔗糖磷酸化酶SPA、dTDP-Glc焦磷酸酶RmlA和无机焦磷酸化酶PPA，发生酶催化反应得到dTDP-D-Glc，可选地，进一步地，由dTDP-D-Glc出发在酶和辅因子再生系统CRS2、CRS3、CRS4和或CRS5存在下发生酶催化反应生成所述胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸dTDP活化的糖核苷酸；在所述补救生物合成途径中，胸腺嘧啶脱氧核苷在生物酶TDK、TMK、NDK以及辅因子再生系统CRS1共同存在下发生酶催化反应得到胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸dTTP，如下式1所示的单糖在酶和ATP的存在下反应生成单磷酸化的单糖，之后再与上述生成的dTTP在酶的存在下发生酶催化反应生成所述胸腺嘧啶脱氧核苷二磷酸dTDP活化的糖核苷酸： 在式1中，R1为OH，R2选自OH、H和AcNH，R3选自CH2OH和COOH， 表示不限定构型的化学键，其中，所述辅因子再生系统CRS1至CRS5分别如下：1CRS1为ATP再生系统，由ATP、磷酸烯醇丙酮酸PEP和丙酮酸激酶PK组成，或者由ATP、聚磷酸盐、聚磷酸激酶PPK组成，或者由ATP、聚磷酸盐、聚磷酸-AMP转移酶和聚磷酸激酶组成，或者由ATP、多聚磷酸、腺苷酸激酶AdK和AMP聚磷酸转移酶PPT组成，或者由ATP、乙酰磷酸、乙酸激酶组成；优选地，所述CRS1由ATP、磷酸烯醇丙酮酸PEP和丙酮酸激酶PK组成，其中，相对于胸腺嘧啶脱氧核苷dT，ATP的用量为0.001～1当量，优选0.03当量，磷酸烯醇丙酮酸PEP的用量为1～10当量，优选4当量，PK:dT的质量比为1:1000～1:1，优选1:500；2CRS2为NADH再生系统，由NAD+、D-葡萄糖和D-葡萄糖脱氢酶BsGH组成，或者由NAD+、脂肪醇例如乙醇、丙醇、异丙醇或异丁醇和醇脱氢酶ADH组成，或者由NAD+、甲酸和甲酸脱氢酶FDH组成，或者由NAD+、亚磷酸盐和亚磷酸脱氢酶PTDH组成；优选地，所述CRS2由NAD+、D-葡萄糖和D-葡萄糖脱氢酶BsGH组成，其中，相对于dTDP-Glc，NAD+的用量为0.001～1当量，优选0.01或0.02当量，D-葡萄糖的用量为1～10当量，优选3当量，BsGH:dTDP-Glc的质量比为1:5000～1:1，优选1:2000或1:1000；3CRS3为NADPH再生系统，由NADP+、D-葡萄糖和BsGH组成，或者由NADP+、6-磷酸葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD组成，或者由NADP+、脂肪醇例如乙醇、丙醇、异丙醇或异丁醇和醇脱氢酶ADH组成，或者由NADP+、甲酸和甲酸脱氢酶FDH组成，或者由NADP+、亚磷酸盐和亚磷酸脱氢酶PTDH组成；优选地，所述CRS3由NADP+、D-葡萄糖和BsGH组成，其中，相对于dTDP-Glc，NADP+的用量为0.001～1当量，优选0.01或0.02当量，D-葡萄糖的用量为1～10当量，优选3当量，BsGH:dTDP-Glc质量比为1:5000～1:1，优选1:2000或1:1000；4CRS4为PMP再生系统，由L-谷氨酸和5'-磷酸吡哆醛PLP组成，优选地，相对于dTDP-Glc，L-谷氨酸的用量为1～10当量，优选5当量，PLP的用量为0.01～1当量，优选0.1当量；5CRS5为AcCoA再生系统，由CoA、ATP、乙酸钠，以及AcCoA合成酶ACS组成，或者由CoA和S-乙酰硫代胆碱碘化物组成，或者由CoA、肉毒碱乙酰转移酶CAT和乙酰肉碱组成，或者由CoA、磷酸转乙酰酶PTA和乙酰磷酸组成；优选地，所述CRS5由CoA、ATP、乙酸钠，以及AcCoA合成酶ACS组成，其中，相对于dTDP-Glc，CoA的用量为0.1～1当量，优选0.5当量，ATP的用量为1～10当量，优选2当量，乙酸钠的用量为1～10当量，优选3当量，ACS:dTDP-Glc质量比为1:5000～1:1，优选1:2000或1:1000，其中，上述辅因子再生系统中，CRS2和CRS3在反应中可以互换使用。所述系统酶是指在单个糖核苷酸合成过程中使用的所有酶的集合。

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