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申请/专利权人：滨州医学院烟台附属医院

摘要：本发明属于细胞技术领域，涉及小鼠肝脏多种原代细胞的分离，是一种用于小鼠肝细胞、肝星状细胞和肝单个核细胞分离和纯化的简易可行方案，适用于一般实验室的小鼠体内相关细胞分离及进一步培养。本发明所提供的方法核心是在小鼠下腔静脉插管的基础上使用胶原酶溶液进行灌注消化，随后经过一系列分离和连续纯化步骤，实现小鼠肝脏中肝细胞、肝星状细胞和肝单个核细胞等多种原代细胞的获取。该发明一定程度上克服了目前肝脏细胞分离方法单一，兼顾了高效、经济，又能避免实验动物滥用的特点，从而为相关肝病体外实验的开展奠定坚实基础。

主权项：1.一种小鼠肝脏逆行灌注消化法同步分离多种原代细胞的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：S1.配制胶原酶溶液：分析天平称取0.0625gIV型胶原酶加入100ml的Hanks培养液中充分混匀配制成浓度为0.05％的胶原酶溶液，使用0.22μm过滤器进行无菌处理，随后放置于37℃水浴锅中至少温育20-30min以备用；S2.密度梯度分离液配制：取percoll原液并摇匀，将9份体积percoll原液与1份体积10×PBS浓缩液充分混匀制成等渗percoll；将10×PBS浓缩液稀释10倍后制成PBS，取2份体积PBS与1份体积等渗percoll配制成33％percoll；S3.小鼠肝脏灌洗：对小鼠肝脏处理后，用50ml注射器吸取预热好的胶原酶溶液并连接输液针，推注胶原酶溶液对肝脏进行灌洗，直至胶原酶溶液充满肝脏，在胶原酶作用下肝实质成分将被消化，结构丧失，仅残留纤维结缔组织和肝包膜；S4.肝脏分化一次处理：用镊子撕破肝包膜，用移液器吸取培养液轻轻吹打并混匀细胞，将所得细胞悬液反复经200目细胞过滤筛过滤；重复过滤步骤2-3次以获得细胞悬液；S5.将过滤后的细胞悬液包含肝脏中所有类型的细胞，将其收集于50ml离心管中，在4℃条件下自然沉降15-30min使其分层；S6.肝细胞分离获取：在步骤S5中的下层沉淀主要为肝细胞，掺杂少量血细胞，将其收集于15ml离心管中，用PBS重悬，50×g离心3min，弃上清，PBS重悬后离心洗涤两次；S7.肝星状细胞分离获取：在步骤S5中的上层悬液富含肝单个核细胞，收集于15ml离心管中，在4℃条件下250×g离心5min，弃上清，PBS洗两次后得沉淀，用5ml的33％percoll将上述沉淀重悬，室温，850×g离心30min，分离结束；离心管中细胞悬液分为上下两层，上层为肝星状细胞，用移液器将其吸出转移至另一15ml离心管，PBS重悬，4℃条件，250×g离心5min，弃上清，PBS洗两次后得沉淀，用培养基重悬用于后续培养；S8.肝单个核细胞分离获取：在步骤S7分离出的下层沉淀主要为肝单个核细胞，用适量PBS重悬并反复经300目细胞过滤筛过滤，250×g离心5min，弃上清，加5ml红细胞裂解液，在4℃裂解15min后，250×g离心5min，弃上清，PBS洗两次后得沉淀，用培养基重悬用于后续培养。

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