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申请/专利权人：南京林业大学

摘要：本发明公开了桂花OfWRKY139基因在增强香气物质合成中的应用，属于植物分子生物学领域。本发明公开了桂花OfWRKY139基因在增强香气物质合成中的应用，OfWRKY139基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明以日香桂盛花期花朵为材料，通过克隆得到桂花OfWRKY139全长基因，在此基础上构建其过量表达载体pBI121‑OfWRKY139，转入桂花花瓣中，得到转基因植株，基因功能鉴定结果表明OfWRKY139基因是增强桂花香气物质合成过程中重要转录因子，可用于桂花基因工程中花香观赏性状的改良及遗传品质等繁育工作。

主权项：1.桂花OfWRKY139基因在增强桂花香气物质合成中的应用，所述桂花OfWRKY139基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的桂花香气物质为S-氧化芳樟醇、E-氧化芳樟醇、茶螺烷、2,6,10,-三甲基十三烷；具体包括以下步骤：1采用TIANGEN植物RNA提取试剂盒提取日香桂盛花期花朵总RNA；采用TaKaRaPrimeScriptTMRTMasterMix反转录试剂盒将所提取到的RNA反转录成cDNA，最后得到的cDNA加水稀释10倍后于-20℃冰箱保存；2获取目的基因片段根据桂花全基因组数据库，筛选得到1个基因序列，与模式植物拟南芥的序列进行比对，判断该基因属于WRKY基因家族，根据该基因家族成员在染色体上的位置命名为OfWRKY139；利用BioXM软件对该基因的核苷酸全长序列进行酶切位点分析，选择XbaI和BamHI作为限制性内切酶酶切位点；利用CEdesign软件设计引物。按要求进行相关信息的填写，具体包括载体上的酶切位点附近的序列、目的基因全长、按照5’端和3’端的顺序填写酶切位点，即可得到扩增引物；设计好的序列由捷瑞生物公司合成；引物序列如下：pBI121-OfWRKY139-F：5’-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGATGGCCTTTGGTAACATGAA-3’，pBI121-OfWRKY139-R：5’-GGACTGACCACCCGGGGATCCAAATACGCACCTCTTCTTGCAAT-3'；以稀释10倍的日香桂OfWRKY139cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为：正向引物pBI121-OfWRKY139-F1μL；反向引物pBI121-OfWRKY139-R1μL；cDNA1μL；PrimeSTAR10μL；ddH2O7μL；PCR反应程序为：98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸2min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应；将扩增产物进行琼脂糖电泳检测，获得目的基因片段；3提前将切pBI121载体从-80℃超低温冰箱中取出进行活化和摇菌，按照质粒提取试剂盒提取pBI121载体质粒，随后进行双酶切实验；反应体系为：限制性内切酶BamHI1μL；限制性内切酶XbaI1μL；Buffer2μL；载体质粒XμL；ddH2O补足至20μL；其中XμL＝1000ng载体质粒浓度ngμL；将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h；将双酶切后的载体进行琼脂糖电泳，然后利用试剂盒进行切胶回收；连接体系如下：目的基因回收产物XμL；pBI121载体双酶切回收产物YμL；连接酶2μL；Buffer1μL；ddH2O补足至20μL；其中XμL＝200ng目的基因回收产物浓度ngμL，YμL＝200ng质粒双酶切回收产物浓度ngμL；将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养30min，冰上2min；转化：超净工作台内，用移液枪取5μL的连接产物于50μL的TreliefTM5α感受态细胞，轻弹混匀，冰浴5min，42℃水浴60s，再冰浴2min，加250μL液体LB，37℃，200rppm的摇床内孵育30min；涂板：取200μL孵育后的菌液，用灭菌的玻璃棒均匀涂布在LB固体培养基上，内含50mgL的Kana并晾干，用封口膜后倒置在37℃恒温培养箱内培养12-14h；4重组质粒筛选当培养基上长出菌后，于超净工作台内进行单菌落检测。每个基因挑取8个饱满的单菌落，依序依次在含Kana抗性的LB固体培养基上进行备份，并用无菌牙签将相应的单菌落沾取至以下20μL体系中进行菌检：pBI121-OfWRKY139-F1μL，pBI121-OfWRKY139-R1μL，GreenMix10μL，ddH2O8μL；PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳，挑取3个长度正确的阳性单菌落送测，测得OfWRKY139基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，片段长度为714bp，编码237个氨基酸的蛋白质，该蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；选取碱基错配率最低的且测序有重复的阳性单菌落提取质粒进行后续实验；5重组质粒转化农杆菌将保存在-80℃超低温冰箱内的GV3101感受态取出放在冰上融化；每33μL感受态加入1μL质粒，吸打混匀后依次冰浴20min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；加500μL无抗性的LB液体培养基，28℃，200rppm摇床上培养1h；培养完成后，将菌液6000r，离心1min，弃去部分上清液，留100μL均匀涂布于LB固体培养基上，内含50mgLKana，封口膜密封，倒置于28℃培养箱中培养40-48h；将备份的板子中相对应的菌落挑入LB液体培养基中摇菌，再将菌液和50％甘油按3:7的体积比保菌，液氮中速冻后保存在-80℃超低温冰箱内；6农杆菌介导转化‘波叶金桂’桂花花瓣摇菌：将pBI121空载、P19辅助表达载体和已转入农杆菌的GUS::pBI121-OfWRKY139目标基因融合表达载体的菌液于-80℃取出常温融化至冰水混合状态后插入冰中融化，按照300μL菌液加入30mLLB液体培养基中含Kana10μg·mL-1，28℃、200rpm避光振荡培养，直至菌液OD600＝0.6-0.8之间；准备混合菌液：称取0.0196g的乙酰丁香酮粉末，使用二甲基亚砜助溶，再加入适量无菌水定容到100mL，获得母液，取母液15mL加入85mL的无菌水，从而获得150μmol·L-1的AS；称取0.2035g的MgCl2和0.2135g的2-N-吗啉乙磺酸一水物加入到配好的150μmol·L-1的AS溶液中；将菌液时进行离心，弃上清，收集菌体，使用当天配制的缓冲液进行重悬，最后按照最佳比例混合，P19辅助载体V：目的基因V＝5:7，充分震荡混匀后活化3h；侵染：选取生长状态良好的桂花花瓣，使用真空泵将混合菌液注入桂花花瓣；培养：将注射过目的基因混合菌液的瞬时转化植物，避光培养48h；最终得到S-氧化芳樟醇、E-氧化芳樟醇、茶螺烷、2,6,10,-三甲基十三烷的含量显著增多的转基因桂花。

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